SABOURAUD-AGAR: GRUNDIERUNG, VORBEREITUNG UND VERWENDUNG - BIOLOGIE - 2025

Der Agar Sabouraud , auch als Sabouraud-Dextrose-Agar bekannt, ist ein festes Medium, das insbesondere zur Isolierung und Entwicklung von Pilzen wie Hefen, Schimmelpilzen und Dermatophyten angereichert ist.

Daher darf dieses Medium in einem mikrobiologischen Labor nicht fehlen, um das Vorhandensein pathogener oder opportunistischer Pilze aus klinischen oder nichtklinischen Proben zu untersuchen. Ebenso ist es auch ideal für das Wachstum von filamentösen Bakterien wie Streptomyces und Nocardias. Seine Verwendung ist sehr weit verbreitet, da es in der Mykologie von Mensch, Tier, Pflanze und Industrie eingesetzt werden kann.

A. Nicht gesäte Sabouraud-Agar. B. Sabouraud-Agar, der mit einer Hefe ausgesät wurde. Quelle: Fotos des Autors MSc. Marielsa Gil

Dieses Medium wurde 1896 von dem bekannten Dermatologen Raimond Sabouraud entwickelt, der zu einem weltbekannten Spezialisten für Erkrankungen der Kopfhaut wurde, die hauptsächlich durch Dermatophyten verursacht wurden.

Seine Schaffung war so wichtig, dass es seitdem verwendet wird und bis heute verwendet wird, wenn auch mit einigen Modifikationen.

Obwohl es speziell für Pilze ist, können Bakterien in diesem Medium wachsen. Daher ist bei Proben mit gemischter Flora die Einbeziehung von Antibiotika in ihre Herstellung erforderlich, um das Wachstum der möglicherweise vorhandenen Bakterienflora zu hemmen.

Die Auswahl des Antibiotikums muss sorgfältig und unter Berücksichtigung der Art des zurückgewinnbaren Pilzes getroffen werden, da einige in Gegenwart bestimmter Substanzen gehemmt werden.

Basis

Sabouraud-Dextrose-Agar ist ein Medium, das in seiner ursprünglichen Formulierung aufgrund seines sauren pH-Werts von 5,6 ± 0,2 schwach selektiv ist. Es können sich jedoch immer noch Bakterien entwickeln, hauptsächlich bei längeren Inkubationen.

Das Medium enthält Kaseinpepton und Pankreasverdauung von tierischem Gewebe, die die Kohlenstoff- und Stickstoffquelle für das Wachstum von Mikroorganismen darstellen.

Es enthält auch eine hohe Konzentration an Glukose, die als Energiequelle fungiert und das Wachstum von Pilzen über Bakterien fördert. All dies gemischt mit Agar-Agar, einer Komponente, die ihm die richtige Konsistenz verleiht.

Andererseits kann Sabouraud-Dextrose-Agar selektiv sein, wenn Antibiotika zugesetzt werden.

Mit Antibiotika ist es besonders nützlich bei Proben von Wunden, offenen Geschwüren oder Proben, bei denen der Verdacht auf eine starke bakterielle Kontamination besteht.

Am häufigsten verwendete Kombinationen von Sabouraud-Dextrose-Agar mit Antibiotika

-Saburaud-Agar mit Chloramphenicol: Ideal zur Rückgewinnung von Hefen und Fadenpilzen.

- Sabouraud-Agar mit Gentamicin und Chloramphenicol: Fast alle Fadenpilze und Hefen wachsen in diesem Medium und hemmen eine große Anzahl von Bakterien, einschließlich Enterobakterien, Pseudomonas und Staphylococcus.

- Sabouraud-Agar mit Cycloheximid: Es ist besonders nützlich für Proben aus der Haut oder den Atemwegen, solange der Verdacht auf dimorphe Pilze besteht.

Cycloheximid sollte mit Vorsicht angewendet werden. Obwohl es verwendet wird, um das Wachstum von nicht pathogenen oder umweltbedingten Pilzen und Hefen zu hemmen, die als Kontaminanten in einer Probe vorhanden sein können, hemmt es auch das Wachstum einiger Pilze wie Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp und anderer opportunistischer Pilze.

- Sabouraud-Agar mit Chloramphenicol plus Cycloheximid: Er wird hauptsächlich zur Isolierung von Dermatophyten und dimorphen Pilzen verwendet. Es hat den Nachteil, dass es einige Arten opportunistischer Pilze wie Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes oder C. neoformans hemmt.

- Sabouraud-Agar mit Chloramphenicol, Streptomycin, Penicillin G und Cycloheximid: Es ist ideal für Proben, die extrem mit Bakterien und saprophytischen Pilzen kontaminiert sind, hat jedoch den Nachteil, dass es zusätzlich zu den oben genannten opportunistischen Pilzen das Wachstum von Actinomyces und Nocardias hemmt.

Vorbereitung

Wenn Sie die Zutaten separat haben, können Sie sie wie folgt zubereiten:

Sabouraud Dextrose Agar

Wiegen:

- 40 g Dextrose

- 10 g Pepton

- 15 g Agar-Agar

- 1000 ml destilliertes Wasser messen

Alle Zutaten werden gemischt, der pH wird auf 5,6 eingestellt. Die gelösten Stoffe werden durch Kochen gelöst, 20 ml des Mediums werden in Röhrchen von 25 x 150 mm ohne Rand und vorzugsweise mit einer Baumwollkappe verteilt.

Röhren mit Baumwollkappe. Quelle: Foto des Autors MSc. Marielsa Gil

Je nach Verfügbarkeit können auch andere Rohrgrößen verwendet werden.

Sie werden 10 Minuten bei einer Druckatmosphäre (121 ° C) autoklaviert. Die Autoklavierzeit sollte nicht überschritten werden. Beim Verlassen des Autoklaven werden die Röhren mit Hilfe eines Trägers geneigt, bis sie sich in einem Flötenschnabel verfestigen.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Zutaten durch Erhitzen aufzulösen, bis sie kochen. 10 Minuten in derselben Durchstechflasche autoklavieren und dann 20 ml in Petrischalen verteilen.

Wenn Sie ein Sabouraud-Dextrose-Agarmedium haben, das bereits alle Inhaltsstoffe enthält, wiegen Sie die vom Handelsunternehmen angegebene Menge für einen Liter Wasser. Die restlichen Schritte sind die gleichen wie oben beschrieben.

Sabouraud Dextrose Agar (Emmons Modifikation)

Wiegen:

- 20 g Dextrose

- 10 g Pepton

- 17 g Agar-Agar

- 1000 ml destilliertes Wasser messen

Alle Zutaten werden gemischt, der pH wird auf 6,9 eingestellt. Gehen Sie wie im vorherigen Fall vor.

Es gibt Handelshäuser, die das Medium mit allen Zutaten anbieten. In diesem Fall wiegen und vorbereiten wie auf dem Einsatz beschrieben.

Sabouraud-Dextrose-Agar (Emmons-Modifikation) mit Chloramphenicol

Chloramphenicol-Stammlösung

- 500 mg Chloramphenicolbase wiegen

- 100 ml 95% iges Ethanol messen

- Mischen

Sabouraud-Dextrose-Agarmedium (Emmons) wird wie zuvor beschrieben hergestellt und zusätzlich für jeden Liter Medium vor dem Autoklavieren 10 ml Chloramphenicol-Stammlösung zugegeben.

Sabouraud Emmons Dextrose Agar mit Cycloheximid

Cycloheximid-Stammlösung

- 5 g Cycloheximid wiegen

- 100 ml Aceton messen

- Mischen

Sabouraud-Dextrose-Agarmedium (Emmons) wird wie bereits beschrieben hergestellt und zusätzlich für jeden Liter Medium vor dem Autoklavieren 10 ml Cycloheximid-Stammlösung zugegeben.

Sabouraud-Dextrose-Agar (Emmons) mit Chloramphenicol und Cycloheximid

Sabouraud-Dextrose-Agarmedium (Emmons) wird wie zuvor beschrieben hergestellt und zusätzlich für jeden Liter Medium vor dem Autoklavieren 10 ml Chloramphenicol-Stammlösung und 10 ml Cycloheximid-Stammlösung zugegeben.

Andere Antibiotika, die hinzugefügt werden können

20.000 bis 60.000 Einheiten Penicillin pro Liter Medium.

30 mg Streptomycin pro Liter Medium.

Beide müssen eingearbeitet werden, nachdem das Medium autoklaviert und leicht abgekühlt wurde (50-55 ° C).

0,04 g Neomycin pro Liter Medium.

0,04 g Gentamicin pro Liter Medium.

Besondere Überlegungen

Aus Sicherheitsgründen wird Sabouraud-Dextrose-Agar lieber in keilförmigen Röhrchen (im Flötenschnabel geneigt) als in Petrischalen ausgesät, um ein Verteilen und Einatmen der Sporen zu vermeiden.

Es ist wichtig, dass Sabouraud-Agarröhrchen mit Baumwolle und nicht mit einem Schraubverschluss bedeckt sind, da gezeigt wurde, dass semi-anaerobe Bedingungen die Sporenbildung bei einigen Stämmen, beispielsweise Coccidioides immitis, hemmen. Außerdem sind die meisten Pilze aerob.

Bei Verwendung eines Schraubverschlusses nicht hermetisch schließen.

QA

Die vorbereiteten Medien müssen einer Qualitätskontrolle unterzogen werden, um ihre ordnungsgemäße Funktion zu überprüfen. Hierzu werden bestimmte Kontrollstämme ausgesät.

Für Sabouraud-Dextrose-Agar mit Chloramphenicol können ATCC-Stämme von Candida albicans verwendet werden, die ein ausgezeichnetes Wachstum aufweisen müssen. Eine andere Platte wird mit Escherichia coli-Stämmen beimpft, die vollständig inhibiert werden müssen.

Eine nicht inokulierte Platte wird ebenfalls inkubiert, in der keine Mikroorganismen wachsen sollten.

Für Sabouraud-Dextrose-Agar mit Chloramphenicol und Cycloheximid können Stämme von Trichophyton-Mentagrophyten verwendet werden, die sich gut entwickeln sollten. Eine andere Platte wird mit einem Stamm von Aspergillus flavus beimpft, in dem es wenig oder kein Wachstum geben muss. Zusätzlich wird eine nicht inokulierte Platte inkubiert, um ihre Sterilität zu demonstrieren.

Für Sabouraud-Dextrose-Agar mit Cycloheximid werden Stämme von Candida albicans, Trichophyton rubrum oder Microsporum canis verwendet, die ein gutes Wachstum aufweisen müssen.

Ebenso ist ein Stamm von Aspergillus flavus enthalten, der wenig oder kein Wachstum zeigt. Zum Schluss inkubieren Sie eine nicht inokulierte Platte, um die Sterilität zu kontrollieren.

Anwendungen

Primärkultur

Klassischer Sabouraud-Dextrose-Agar enthält 4 Gramm Dextrose und eignet sich hervorragend als primäres Isolationsmedium, da er die charakteristische Morphologie jedes Pilzes zeigt.

Es eignet sich auch hervorragend zum Nachweis der Pigmentproduktion. Es ist jedoch nicht das beste Mittel, um die Sporulation zu beobachten.

Es wird auch nicht für die Kultivierung von Blastomyces dermatitidis empfohlen, die durch die hohe Konzentration an vorhandener Glucose gehemmt wird.

Andererseits müssen bei der Kultivierung bestimmte Überlegungen berücksichtigt werden.

Einige Pilze wachsen am besten bei Raumtemperatur, wie Schimmelpilze, andere wachsen erfolgreich bei 37 ° C, wie einige Hefen, und andere können bei beiden Temperaturen wachsen (dimorphe Pilze).

Aus diesem Grund ist es manchmal erforderlich, mehrere Sabouraud-Agarplatten für dieselbe Probe zu verwenden, da häufig eine doppelte Aussaat durchgeführt wird, um eine Platte bei Raumtemperatur und eine andere bei 37 ° C zu inkubieren.

Zum Beispiel wird Sporothrix schenckii in zwei Platten gesät; Eine wird bei Raumtemperatur inkubiert, um die Schimmelpilzphase zu erhalten, und die andere wird bei 37 ° C inkubiert, um die Hefephase zu erhalten. Bei letzterer ist es jedoch erforderlich, dem Medium 5% Blut zuzusetzen.

In anderen Fällen, wie beispielsweise bei Mycetomproben, werden zwei Sabouraud-Agarplatten ausgesät, eine mit Chloramphenicol und die andere mit Cycloheximid. Das erste ermöglicht das Wachstum von Mykotom-Erregern pilzlichen Ursprungs (Eumycetoma) und des zweiten Erregers von Myketomen bakteriellen Ursprungs, wie Actinomycetomen.

Sporulation

Emmons Modified Sabouraud Dextrose Agar enthält 2 Gramm Dextrose und wird nicht nur zur Isolierung, sondern auch zur Sporulation und Konservierung von Pilzen verwendet.

In diesem Medium können Stämme von Blastomyces dermatitidis gewonnen werden.

Erhaltung

Um Pilzkulturen zu konservieren, können sie im Kühlschrank (2-8 ° C) aufbewahrt werden. Die Konservierungszeit kann zwischen 2 und 8 Wochen variieren. Nach dieser Zeit müssen sie subkultiviert werden, um den Vorgang zu wiederholen.

Einige Pilze wie Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum und Microsporum audounii halten sich am besten bei Raumtemperatur.

Die Aufrechterhaltung des Stammes kann verlängert werden, um Pleomorphismus zu vermeiden, wenn die Dextrose vollständig vom Agar entfernt wird und wenn die Menge an Agar im Medium verringert wird, um Trockenheit zu vermeiden.

Mikrokulturen

Zur Identifizierung einiger Fadenpilze ist es notwendig, Mikrokulturen unter Verwendung von Sabouraud-Agar oder anderen speziellen Mitteln durchzuführen, um die Strukturen der sexuellen und asexuellen Fortpflanzung zu beobachten.

In der menschlichen Mykologie

Es wird hauptsächlich zur Diagnose von Pilzkrankheiten verwendet, insbesondere solchen, die die Haut und ihre Anhaftungen (Haare und Nägel) betreffen.

Die Proben können Sekrete, Exsudate, Haut, Haare, Nägel, Auswurf, Liquor oder Urin sein. Häufig isolierte Krankheitserreger sind Dermatophyten, Pilze, die subkutane und systemische Mykosen verursachen.

Tiermykologie

Tiere sind häufig von Pilzinfektionen betroffen, daher ist Sabouraud-Agar in der Tiermykologie genauso nützlich wie beim Menschen.

Beispielsweise können Dermatophyten häufig Tiere betreffen. Dies ist der Fall bei Microsporum canis var distortum, das häufig Hunde, Katzen, Pferde, Schweine und Affen infiziert. Ebenso infiziert Microsporum gypseum Hunde, Katzen und Nutztiere.

Vögel wie Hühner, Hähne und Hühner sind von Microsporum gallinae betroffen.

Andere Pilze wie Zymonema farciminosum sind ebenfalls die Krankheitsursache bei Tieren, hauptsächlich bei Pferden, Maultieren und Eseln, und verursachen signifikante Entzündungen in den Lymphgefäßen.

Sporothrix schenkii und Histoplasma capsulatum betreffen Haustiere und Menschen.

Umweltmykologie

Viele pathogene oder opportunistische Pilze können sich zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer bestimmten Umgebung konzentrieren, insbesondere in Operationssälen und Intensivstationen von Kliniken und Krankenhäusern. Daher ist es notwendig, eine Kontrolle über sie durchzuführen.

Andere gefährdete Räume sind Bibliotheken und alte Gebäude, die durch die Konzentration von Umweltpilzen beeinträchtigt werden können.

In Umweltstudien wird Sabouraud-Dextrose-Agar zur Isolierung von Pilzen verwendet.

Industrielle Mykologie

Sabouraud-Dextrose-Agar darf nicht fehlen, um unter anderem kontaminierende Pilze bei der Herstellung von Kosmetika, Lebensmitteln, Getränken, Leder und Textilien zu untersuchen.

Pflanzenmykologie

Pflanzen leiden auch an durch Pilze verursachten Krankheiten, die verschiedene Pflanzenteile betreffen und sogar die Ernte beenden können, was zu großen Verlusten in der Landwirtschaft führt.

Verweise

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