STANDARD-AGARPERLE: BASIS, VORBEREITUNG UND VERWENDUNG - BIOLOGIE - 2025

Der Standardzählagar ist ein festes, nicht selektives Kulturmedium, das unter anderem zur Quantifizierung der aeroben mikrobiellen Belastung in Proben von Trinkwasser, Abwasser und Milchgetränken bestimmt ist. Dieses Medium ist auch als PCA-Agar bekannt, für sein Akronym in English Plate Count Agar. Es wurde 1953 von Buchbinder, Baris und Goldstein gegründet.

Das Standardzählagarmedium besteht aus Hefeextrakt, Triptein, Glucose, Agar und destilliertem Wasser. Diese Formulierung enthält grundlegende Ernährungselemente, die die Entwicklung der gegenwärtigen aeroben mikrobiellen Belastung ermöglichen, ohne es zu fordern.

Dezimalverdünnungen zum Zählen von CFUs in Standardagarzahlen. Quelle: Quentin Geissmann

Da das Medium keine Inhibitoren enthält, können Bakterien ohne Einschränkungen wachsen, was es ideal für die allgemeine Kolonienzählung macht. Die Plaque-Quantifizierungstechnik erkennt jedoch nicht alle vorhandenen Bakterien, sondern nur diejenigen, die unter den Umgebungsbedingungen wachsen können, denen der ausgesäte Standardzählagar ausgesetzt ist.

In diesem Sinne versucht die Plattenquantifizierungstechnik im Allgemeinen, die Menge an Bakterien vom aeroben mesophilen Typ zu bestimmen, dh diejenigen, die bei Temperaturen zwischen 25 und 40 ° C mit einer optimalen Wachstumstemperatur von 37 ° C wachsen. .

Diese Bakteriengruppe ist sehr wichtig, da dort die meisten pathogenen Bakterien für den Menschen gefunden werden.

Es sollte beachtet werden, dass es manchmal interessant sein kann, die Menge an psychrophilen Bakterien in Lebensmitteln zu quantifizieren. Diese Bakterien wachsen bei niedrigen Temperaturen (<20 ° C) und sind dafür verantwortlich, dass sich Lebensmittel auch im Kühlschrank schneller zersetzen.

Ebenso können thermophile Bakterien, die sich in einem Bereich zwischen 50 ° C und 80 ° C oder mehr entwickeln, bei bestimmten Arten von Lebensmitteln wie Konserven wichtig sein.

Die mikrobielle Quantifizierung wird in koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Gramm oder Milliliter Probe ausgedrückt.

Basis

Standard Count Medium wurde entwickelt, um das erfolgreiche Wachstum nicht anspruchsvoller aerober Bakterien zu ermöglichen, da Hefeextrakt, Triptein und Glucose die Nährstoffe liefern, die für ein ordnungsgemäßes mikrobielles Wachstum erforderlich sind.

Andererseits hat das Medium eine helle Farbe und ein transparentes Aussehen, weshalb es ideal für die Visualisierung von Kolonien ist, die durch die Deep-Seeding-Methode (Eingießen in eine Platte) entwickelt wurden.

Eine Kolonienzählung nach der Drigalski-Spatel-Oberflächen-Seeding-Methode ist ebenfalls möglich.

Wenn die mikrobielle Belastung hoch ist, müssen Dezimalverdünnungen der Untersuchungsprobe vorgenommen werden, um die KBE zählen zu können.

Es ist zu beachten, dass dieses Medium von der American Public Health Association (APHA) für die Zählung von aeroben Mesophilen empfohlen wird.

Vorbereitung

23,5 g des dehydrierten Mediums werden gewogen und in einem Liter destilliertem Wasser gelöst. Um sich vollständig aufzulösen, sollte die Mischung durch häufiges Rühren erhitzt werden, bis sie kocht. Nachfolgende Schritte hängen von der zu verwendenden Aussaattechnik ab.

Für die Gießplattentechnik

Verteilen Sie es, indem Sie 12 bis 15 ml in Reagenzgläser geben. Anschließend in einem Autoklaven 15 Minuten bei 121 ° C sterilisieren. Vertikal in Form eines Blocks erstarren lassen. Bis zur Verwendung im Kühlschrank aufbewahren.

Schmelzen Sie den Stecker, wenn Sie ihn verwenden möchten. Nach dem Schmelzen in einem Wasserbad bei 44-47 ° C aufbewahren, während die Proben vorbereitet werden.

Zur Oberflächensaat

Sterilisieren Sie das Medium in einem Autoklaven bei 121 ° C und verteilen Sie dann 20 ml in sterilen Petrischalen. Erstarren lassen, umdrehen und bis zur Verwendung im Kühlschrank aufbewahren.

Temperplatten vor Gebrauch. Der pH-Wert des Mediums sollte 7,0 ± 0,2 betragen.

Verwenden

Standardzählagar wird in der aeroben mesophilen Zähltechnik während der mikrobiologischen Analyse von Wasser und Lebensmitteln verwendet. Die Zählung der aeroben Mesophilen ist notwendig, da sie die hygienische Qualität der untersuchten Probe bestimmt.

Die Anwendung dieser Technik (unter Verwendung dieses Mediums) ermöglicht die makroskopische Visualisierung isolierter Kolonien zur Quantifizierung.

Plattengusstechnik (Tiefensaat)

-Prozess

Die Technik besteht aus Folgendem:

1) Homogenisieren Sie die Probe, um die vorhandenen Bakterien neu zu verteilen.

2) Eine anfängliche Suspension wird in einer sterilen Flasche oder einem sterilen Beutel unter Berücksichtigung des Verhältnisses von 10 g oder 10 ml Probe in 90 ml Verdünnungsmittel (10 ^–1 ) hergestellt.

3) Ausgehend von der anfänglichen Suspension werden die entsprechenden Dezimalverdünnungen in Abhängigkeit von der Art der Probe vorgenommen. Beispiel: (10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ). Verdünnungen werden mit Peptonwasser oder Phosphatpuffer durchgeführt.

Nehmen Sie dazu 1 ml der ursprünglichen Suspension und geben Sie sie in 9 ml Verdünnungsmittel. Setzen Sie die Verdünnungen gegebenenfalls fort, nehmen Sie nun 1 ml der ^10-2- Verdünnung und so weiter.

4) Nehmen Sie 1 ml jeder Verdünnung und legen Sie sie in leere sterile Petrischalen.

5) Zu jeder Platte 12 bis 15 ml Standardzählagar geben, der zuvor geschmolzen und bei 44 - 47 ° C abgesetzt wurde.

6) Drehen Sie die Platten vorsichtig, um die Probe gleichmäßig auf dem Agar zu verteilen und erstarren zu lassen.

7) Drehen Sie die Platten um und inkubieren Sie 24 bis 48 Stunden bei 37 ° C in Aerobiose.

8) Am Ende der Zeit werden die Platten untersucht und die Kolonien in der Verdünnung gezählt, die dies zulässt. Die Platten mit 30 bis 300 KBE werden für die Zählung ausgewählt.

Das Zählen kann manuell erfolgen oder Sie können die Koloniezählerausrüstung verwenden.

Die zulässigen Werte pro ml Probe können von Land zu Land unterschiedlich sein, abhängig von den Vorschriften, für die sie gelten.

-Berechnung von UFC

Die allgemeine Berechnung erfolgt nach folgender Formel:

Formel zur allgemeinen Berechnung der Quantifizierung von KBE. Quelle: Nationale Verwaltung für Arzneimittel, Lebensmittel und Medizintechnik (ANMAT). Mikrobiologische Analyse von Lebensmitteln, offizielle Analysemethode, Indikatormikroorganismen. 2014 Band 3. Verfügbar unter: anmat.gov.ar

Drücken Sie die Ergebnisse in 1 oder 2 Ziffern aus und multiplizieren Sie sie mit der entsprechenden Basis 10. Beispiel: Wenn das Ergebnis 16.545 ist, wird es basierend auf der dritten Ziffer auf 17.000 gerundet und wie folgt ausgedrückt: 1,7 x 10 ⁴ . Wenn das Ergebnis 16.436 wäre, runden Sie es auf 16.000 und drücken Sie 1,6 x 10 ^{4 aus} .

Oberflächen-Seeding-Technik

-Prozess

-Inocular mit 0,1 ml der direkten Probe , wenn sie flüssig ist , Erstverdünnungen 10 ^-1 oder der aufeinanderfolgenden Verdünnungen 10 ^-2 , 10 ^-3 etc, in der Mitte eines Standard - Count - Agar - Platte.

- Verteilen Sie die Probe gleichmäßig mit einem Drigalski-Spatel oder einem L-förmigen Glasstab. Lassen Sie sie 10 Minuten ruhen.

- Die Platten umdrehen und 24 bis 48 Stunden bei 37 ° C aerob inkubieren.

- Fahren Sie mit dem Zählen der Kolonien fort und wählen Sie die Platten aus, die sich in einem Bereich zwischen 20 und 250 KBE befinden.

-Berechnung von UFC

Für die Berechnung wird der Verdünnungsfaktor angewendet, der umgekehrt ist. Die Zahl wird auf 2 signifikante Ziffern gerundet (Rundung nach der dritten Stelle) und wird in Kraft der Basis 10 beispielsweise ausgedrückt, wenn 224 CFU in der Probe ohne Verdünnung gezählt (10 ^-1 ), 22 x 10 ¹ CFU wird berichtet Wenn die Zahl jedoch 225 wäre, wird 23 x 10 ¹ KBE angegeben.

Wenn nun 199 KBE in der ^10-3- Verdünnung gezählt werden , werden 20 x 10 ⁴ KBE gemeldet, aber wenn 153 KBE in derselben Verdünnung gezählt werden, werden 15 x 10 ⁴ KBE gemeldet.

QA

Das Standard-Zählkulturmedium kann unter Verwendung bekannter zertifizierter Stämme bewertet werden, wie: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Wenn sich das Kulturmedium unter optimalen Bedingungen befindet, wird in allen Fällen ein zufriedenstellendes Wachstum erwartet, mit Ausnahme von L. fermentum, das eine regelmäßige Ausbeute aufweisen kann.

Um die Sterilität des Kulturmediums zu bewerten, sollten eine oder zwei Platten jeder hergestellten Charge (ohne Inokulation) 24 Stunden bei 37 ° C in Aerobiose inkubiert werden. Nach dieser Zeit sollte im Medium kein Wachstum oder Farbwechsel mehr beobachtet werden.

Einschränkungen

- Schmelzen Sie den Agar nicht mehr als einmal.

-Das vorbereitete Medium kann bis zu 3 Monate halten, solange es im Kühlschrank aufbewahrt und vor Licht geschützt wird.

-Dieses Medium ist nicht für anspruchsvolle oder anaerobe Mikroorganismen geeignet.

Verweise

1. Nationale Verwaltung für Arzneimittel, Lebensmittel und Medizintechnik (ANMAT). Mikrobiologische Analyse von Lebensmitteln, offizielle Analysemethode, Indikatormikroorganismen. 2014 Band 3. Verfügbar unter: anmat.gov.ar
2. Laboratorien Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plattenzählagar. 2009. Verfügbar unter: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa Laboratories. Standard Method Agar (PCA) gemäß APHA und ISO 4833. Verfügbar unter: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Agar Tellerzahl. 2015. Verfügbar unter: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B und Velázquez O. 2009. Techniken zur mikrobiologischen Analyse von Lebensmitteln. 2nd ed. Fakultät für Chemie, UNAM. Mexiko. Verfügbar unter: depa.fquim.unam