IMMUNFLUORESZENZ: BEGRÜNDUNG, PROTOKOLL UND ANWENDUNGEN - BIOLOGIE - 2025

Die Immunfluoreszenz ist eine leistungsstarke Technik zur Immunfärbung unter Verwendung von Antikörpern, die kovalent an fluoreszierende Moleküle gebunden sind, um spezifische Ziele in Zellproben zu identifizieren, die auf einem festen Träger fixiert sind.

Diese Technik beinhaltet eine mikroskopische Beobachtung mit immunologischer Spezifität, die es ermöglicht, lebende oder tote Zellen zu beobachten, die winzige Mengen an Antigenen präsentieren können. Es ist sowohl auf dem Gebiet der Forschung als auch in der klinischen Diagnose verschiedener Pathologien weit verbreitet.

Immunmarkierung von Aktinfilamenten in Kardiomyozytenzellen (Quelle: Ps1415 über Wikimedia Commons)

Diese hauptsächlich qualitative Technik (mit einigen quantitativen Varianten) hat speziell mit der Visualisierung einer Probe durch das Produktsignal eines Fluorophors zu tun, bei dem es sich um ein an einen Antikörper gebundenes fluoreszierendes Molekül handelt, das bei einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden kann .

Im zellulären Kontext ist es sehr nützlich, das Vorhandensein / Fehlen und die subzelluläre Position von Proteinen zu untersuchen. Die Technik wurde ursprünglich im klinischen Umfeld zur Diagnose von Viren wie Influenza und anschließend für viele andere Infektionskrankheiten eingesetzt.

Es ist eine hochempfindliche Technik und kann mit den entsprechenden Mikroskopiegeräten eine sehr gute Auflösung haben. Für seine Beobachtung sind konfokale oder Epifluoreszenzmikroskope erforderlich.

Obwohl es sehr beliebt ist, kann es einige wichtige Probleme in Bezug auf das Erhalten einer unspezifischen Fluoreszenz darstellen, die ein gewisses Hintergrundrauschen erzeugt, was häufig das angemessene Ablesen der Ergebnisse einschränkt.

Basis

Die Immunfluoreszenz basiert auf der Ausnutzung des biologischen Phänomens der Wechselwirkungsreaktion zwischen einem Antikörper und einem Antigen. Dies hat speziell mit der Visualisierung oder Detektion dieser Reaktion durch Anregung fluoreszierender Moleküle auf eine bestimmte Wellenlänge zu tun.

Ein Antikörper ist ein Immunglobulinprotein, das aus aktiven B-Zellen ausgeschieden wird und spezifisch gegen ein Antigen erzeugt wird, an das es mit hoher Affinität und Spezifität binden kann. Bei der Immunfluoreszenz werden IgG-Immunglobuline verwendet, die im Blutserum löslich sind.

Antikörper sind Moleküle bis 950 kDa, die aus zwei kurzen (leichten) und zwei langen "Y" -förmigen (schweren) Peptidketten bestehen. Sowohl die leichte als auch die schwere Kette sind in zwei Domänen unterteilt: eine Variable, die das Antigen erkennen kann, und die andere konstante oder konservierte, für jede Spezies charakteristische.

Antigene werden funktionell als Moleküle definiert, die von einem Antikörper erkannt werden können und größtenteils Proteine ​​sind. Wenn ein Tier einem Antigen ausgesetzt wird, werden die Lymphozyten des Immunsystems aktiviert, wodurch spezifische Antikörper gegen das Tier erzeugt werden, die als Abwehrsystem fungieren.

Ein Antigen, wie beispielsweise ein Protein, kann mehr als ein Epitop oder eine Erkennungsstelle durch einen Antikörper aufweisen, so dass das Serum des Tieres, das einem Antigen ausgesetzt ist, polyklonale Antikörper gegen verschiedene Regionen desselben Proteins aufweisen kann.

Die Immunfluoreszenz nutzt dann die Fähigkeit eines Tieres, polyklonale Antikörper gegen ein bestimmtes Antigen zu produzieren, um es zu reinigen und anschließend zum Nachweis desselben Antigens in anderen Zusammenhängen zu verwenden.

Zu den fluoreszierenden Farbstoffen oder Molekülen, die für einige Immunfluoreszenztechniken am häufigsten verwendet werden, gehören Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat-5 und 6 (TRITC), viele Cyanine wie Cy2, Cy3, Cy5 und Cy7 sowie Farbstoffe namens Alexa Fluor® , wie der Alexa Fluor®448.

Protokoll

Das Immunfluoreszenzprotokoll variiert in Abhängigkeit von vielen Faktoren, umfasst jedoch im Allgemeinen eine lineare Abfolge von Schritten, bestehend aus:

• Vorbereitung der Platten und Zellen
• Fixierung von Proben
• Permeabilisierung
• Blockierung
• Immunfärbung oder Immunfärbung
• Montage und Beobachtung

-Vorbereitung

Von den Proben

Die Vorbereitung der Proben hängt von ihrer Art und der Art der durchzuführenden Erfahrung ab. Der einfachste Fall, bei dem Zellen in Suspension verwendet werden, wird nachstehend erläutert.

Zellen in Suspension, dh in einem flüssigen Kulturmedium, müssen zuerst durch Zentrifugation von diesem getrennt und dann mit einer Pufferlösung oder einem isosmotischen "Puffer" gewaschen werden, der ihre Integrität bewahrt.

Normalerweise wird ein Phosphat-Salz-Puffer verwendet, der als PBS bekannt ist, in dem die Zellen resuspendiert werden und diese Mischung erneut zentrifugiert wird, um die Zellen frei von dem Kulturmedium zu erhalten, das störende Substanzen enthalten kann.

Von den Klingen

Die für die mikroskopische Beobachtung verwendeten Objektträger, bei denen die Zellen später für die entsprechenden nachgeschalteten Behandlungen fixiert werden, müssen ebenfalls sorgfältig vorbereitet werden.

Diese werden mit einer Lösung von Polylysin bedeckt oder "sensibilisiert", einem synthetischen Polymer, das dank der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen den positiven Ladungen ihrer Aminogruppen und dem als "molekularer Klebstoff" zwischen den Zellen und dem festen Träger fungiert negative Ladungen auf den Proteinen, die Zellen beschichten.

Fixierung von Proben

Dieser Prozess besteht darin, die in der Zelle gefundenen Proteine ​​zu immobilisieren, um ihre räumliche Position intakt zu halten. Die verwendeten Moleküle müssen in der Lage sein, alle Arten von Zellmembranen zu kreuzen und mit den kovalenten Proteinen Gitter zu bilden.

Formaldehyd und Paraformaldehyd, Glutaraldehyd und sogar Methanol sind weit verbreitet, mit denen Zellproben für eine bestimmte Zeit inkubiert und dann mit einer isosmotischen Pufferlösung gewaschen werden.

Nach dem Fixieren der Zellen werden sie weiterhin an den zuvor mit Polylysin sensibilisierten Blättern befestigt.

Permeabilisierung

Abhängig von der Art des durchgeführten Tests ist es erforderlich, die untersuchten Zellen zu permeabilisieren oder nicht. Wenn gesucht wird, den Ort, das Vorhandensein oder das Fehlen eines bestimmten Proteins auf der Zelloberfläche zu kennen, ist eine Permeabilisierung nicht erforderlich.

Wenn Sie andererseits wissen möchten, wo sich ein Protein in der Zelle befindet, ist die Permeabilisierung unerlässlich und besteht aus der Inkubation der Proben mit Triton X-100, einem Detergens, das Zellmembranen permeabilisieren kann.

Blockierung

Ein grundlegender Schritt bei allen immunologischen Techniken ist das Blockieren. In dieser Phase des Verfahrens besteht das Blockieren darin, auf den sensibilisierten Blättern alle Stellen mit Polylysinmolekülen zu bedecken, an denen die Zellen nicht hafteten. Das heißt, es verhindert eine unspezifische Vereinigung.

Normalerweise werden Lösungen mit Rinderserumalbumin (BSA) in PBS-Puffer zum Blockieren verwendet und die besten Ergebnisse werden erzielt, je länger die Inkubationszeit mit dieser Lösung ist. Nach jedem Schritt, einschließlich des Blockierens, muss die verbleibende Lösung abgewaschen werden.

Immunfärbung oder Immunfärbung

Das Immunfärbungs- oder Immunfärbeverfahren hängt hauptsächlich davon ab, ob es sich um eine direkte oder indirekte Immunfluoreszenz handelt (siehe unten).

Wenn es sich um eine primäre oder direkte Immunfluoreszenz handelt, werden die Proben mit den gewünschten Antikörpern inkubiert, die an die Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt werden müssen. Das Inkubationsverfahren besteht darin, den Antikörper in einer Lösung zu verdünnen, die ebenfalls BSA enthält, jedoch in einem geringeren Anteil.

Wenn es sich um eine sekundäre oder indirekte Immunfluoreszenz handelt, sollten zwei aufeinanderfolgende Inkubationen durchgeführt werden. Zuerst mit den gewünschten Antikörpern und dann mit den Antikörpern, die in der Lage sind, die konstanten Regionen der primären Immunglobuline nachzuweisen. Es sind diese Sekundärantikörper, die kovalent an Fluorophore gebunden sind.

Die Technik ist sehr vielseitig und ermöglicht die gleichzeitige Markierung von mehr als einem Antigen pro Probe, sofern im Falle einer direkten Immunfluoreszenz Primärantikörper an verschiedene Fluorophore gekoppelt sind.

Für die gleichzeitige Markierung bei indirekter Immunfluoreszenz muss sichergestellt werden, dass jeder Primärantikörper in einem anderen Tier produziert wird und dass jeder Sekundärantikörper an ein anderes Fluorophor gekoppelt ist.

Wie beim Blockieren liefert die Inkubation mit Antikörpern bessere Ergebnisse, je länger dies dauert. Nach jedem Schritt ist es notwendig, die überschüssigen Antikörper abzuwaschen, die nicht an die Proben gebunden haben, und bei der sekundären Immunfluoreszenz ist es notwendig, vor der Zugabe des sekundären Antikörpers zu blockieren.

Bestimmte Techniken verwenden andere Färbungen, die nicht mit Immunfärbung zusammenhängen, wie beispielsweise die Färbung von Kern-DNA mit dem DAPI-Fluorophor.

Montage und Beobachtung

Während der letzten Inkubationszeit mit den Fluorophoren müssen die Proben im Dunkeln bleiben. Zur Beobachtung unter dem Mikroskop werden üblicherweise einige Substanzen verwendet, um die Fluoreszenz der an die Antikörper gekoppelten Fluorophore zu erhalten.

Typen

Grafische Zusammenfassung der direkten und indirekten Immunfluoreszenz (Quelle: Westhayl618 über Wikimedia Commons)

Direkte oder primäre Immunfluoreszenz

Es geht um den Nachweis von Antigenen durch den Einsatz fluoreszierender Antikörper. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Geschwindigkeit. Es können jedoch viele Fälle unspezifischer Bindung auftreten, insbesondere bei der Untersuchung von Humanseren, da diese reich an sehr heterogenen Antikörpern sind.

Indirekte oder sekundäre Immunfluoreszenz

Es ist auch als "Sandwich" -Technik bekannt und dies beinhaltet die Entwicklung der Technik in zwei Schritten. Das erste hat mit der Verwendung eines nicht fluoreszierenden Antikörpers und seiner Bindung an das interessierende Antigen zu tun.

Gegen die konstante Region dieses ersten Antikörpers (der nun als Antigen dienen wird) wird ein zweiter Antikörper verwendet, der es erkennen kann und mit einem fluoreszierenden Molekül assoziiert ist.

Das Auftreten eines fluoreszierenden Signals ist das Ergebnis einer spezifischen Erkennung zwischen dem ersten nicht fluoreszierenden Antikörper und dem interessierenden Antigen; Das Vorhandensein dieses ersten Antikörpers bedingt das des zweiten, der markiert ist und dank dessen das Vorhandensein oder Fehlen des Antigens bestimmt werden kann.

Obwohl diese Technik eine viel zeitaufwändigere Technik als die direkte Immunfluoreszenz ist (da sie einen weiteren Inkubationsschritt umfasst), beinhaltet diese Technik nicht das Design eines fluoreszierenden Antikörpers für jedes untersuchte Antigen, was in wirtschaftlicher Hinsicht zu Ergebnissen führt. lebensfähiger.

Darüber hinaus ist es eine empfindlichere Technik hinsichtlich der Signalverstärkung, da mehr als ein sekundärer Antikörper an die konstante Region des primären Antikörpers binden kann, wodurch die Intensität des fluoreszierenden Signals verstärkt wird.

Anwendungen

Wie bereits erwähnt, ist die Immunfluoreszenz eine äußerst vielseitige Technik, die auf vielfältige Weise im wissenschaftlichen und klinischen Bereich eingesetzt wurde. Es kann verwendet werden, um ökologische, genetische und physiologische Fragen zu vielen Organismen zu beantworten.

Unter den klinischen Anwendungen wird es zur direkten Diagnose einiger dermatologischer Erkrankungen verwendet, entweder unter Verwendung der direkten oder indirekten Immunfluoreszenz auf Epithelgewebe der untersuchten Patienten.

Immunfluoreszenztechniken waren in einzelligen Organismen wie Hefe verfügbar, um intranukleäre und zytoplasmatische Mikrotubuli, Aktin und assoziierte Proteine, 10-nm-Filamente und andere Bestandteile des Zytoplasmas, der Membran und der Zellwände sichtbar zu machen.

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