WRIGHTS FLECK: BEGRÜNDUNG, MATERIALIEN, TECHNIK UND VERWENDUNG - BIOLOGIE - 2025

Die Wright- Färbung ist eine Färbetechnik, die der amerikanische Pathologe James Homer Wright 1902 auf der Grundlage der Romanowsky-Färbung entwickelt hat. Da der Romanowsky-Fleck instabil war, enthielt Wright Methanol als Lösungsmittel und Fixiermittel.

Diese Färbung ist polychromatisch, was bedeutet, dass sie abhängig von der Struktur, die den Farbstoff absorbiert, mehrere Farben erzeugt. Diese Färbetechnik wurde häufig verwendet, um unterschiedliche Leukozytenzahlen durchzuführen und die Morphologie von roten Blutkörperchen, Blutplättchen und Leukozyten in peripherem Blut und Knochenmark zu untersuchen.

Verschiedene periphere Blutausstriche, die mit Wright-Färbung gefärbt sind. A. Akute Leukämie B. Plasmodium vivax innerhalb des Erythrozyten. C. Plasmodium falciparum, Makrogametozyten. D. Lymphozyten

Seine Anwendung ist sehr wichtig, da Anomalien in den verschiedenen Zelllinien des Blutes auftreten können, was die Diagnose von Krankheiten wie Leukämie oder bakteriellen oder parasitären Infektionen erleichtert.

Vielleicht sind dies die häufigsten Anwendungen, in denen diese Technik verwendet wird, aber sie sind nicht die einzigen. Es ist auch nützlich in anderen Proben als Blut und Knochenmark, wie z. B. Nasenausfluss, Stuhlschleim, Auswurf, Hautproben, unter anderem.

Begründung für Wrights Fleck

Wrights Färbung wurde aus Romanowskys Färbung geboren, die aus einer Methylalkohollösung eines sauren Farbstoffs (Eosin Y) und eines basischen Farbstoffs (Methylenblau) und deren Oxidationsprodukten besteht.

Die in Wrights Färbung verwendete Farbstoffmischung bewirkt den als Romanowsky bekannten Effekt, dh sie verleiht den Kernen von Leukozyten und neutrophilen Granulaten eine schöne violette Färbung, während die roten Blutkörperchen rosa färben.

Die Komponenten, die für die typische Farbskala der Wright-Färbung verantwortlich sind, sind Blau B und Eosin Y. Der beobachtete Effekt hängt von der Bindung der Farbstoffe an die chemischen Strukturen und den Wechselwirkungen von Blau B und Eosin Y ab.

Saure Strukturen wie Nukleinsäuren, Kernproteine ​​und reaktives unreifes Zytoplasma einiger Zelltypen fixieren Blau B (Grundfärbung).

Während die Grundstrukturen wie Hämoglobin das Granulat der segmentierten Eosinophilen neben anderen Zellstrukturen das Eosin Y (Säurefarbstoff) fixieren.

Das Färbeergebnis kann durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden, wie den pH-Wert des Wright-Farbstoffs, des Puffers und der Waschlösung; sowie die Färbe- und Fixierungszeit.

Daher ist jeder Schritt bei der Herstellung der Reagenzien von entscheidender Bedeutung und muss mit Liebe zum Detail durchgeführt werden.

Materialien

Wrights Fleck. Für 100 ml ist erforderlich:

0,3 g Wright-Färbung abwiegen, 97 ml Methanol und 3 ml Glycerin messen.

Vorbereitung

In einen Mörser die große Menge von Wrights Farbstoff geben und das Glycerin allmählich einarbeiten, bis sich das Pulver vollständig aufgelöst hat.

Anschließend wird das Methanol zugegeben, gemischt und in eine Bernsteinflasche gegossen.

Vor dem Gebrauch sollte die Lösung mit leichten Bewegungen geschüttelt und filtriert werden.

Gepufferte Pufferlösung

In einem Liter destilliertem Wasser werden 3,76 g Dinatriumhydrophosphat (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) plus 2,1 g Dihydrogenkaliumphosphat (KH ₂ PO ₄ ) zugegeben.

Sehr gut mischen, bis alle eingebauten Reagenzien gelöst sind. Stellen Sie den pH auf 7,2 ein. In ein Glas gießen und bei Raumtemperatur aufbewahren.

Zusätzliche Materialien für die Färbung

Zusätzlich sind andere Materialien erforderlich, um die Färbetechnik ausführen zu können. Dies sind: Objektträger oder -abdeckungsobjekte, Farbbrücke, T-Shirts mit Wasser oder Puffer zum Waschen, ein Timer zum Einhalten der Färbezeiten und etwas Trocknungsmaterial (saugfähiges Papier, Mull oder Baumwolle).

Bestandteile von Wrights Fleck

Methanol

Alkohol (Methanol) dient als Fixiermittel für den Blutausstrich auf dem Objektträger.

Es ist im Grunde ein Gerinnungsmittel, das das Reagenz reduziert, entwässert und fixiert. Daher besteht seine Funktion darin, Proteine ​​zu koagulieren und unlöslich zu machen, ohne sie jedoch tatsächlich zu denaturieren.

Methanol ist das in allen Labors am häufigsten verwendete Abstrichfixierungsreagenz, da es bessere Ergebnisse liefert als Ethanol. Die ideale Konzentration beträgt 99%.

Dämpfer

Der Puffer (gepufferte Lösung) hat die Funktion, den pH-Wert des Farbstoffs einzustellen oder aufrechtzuerhalten, da ein auf 7,2 eingestellter pH-Wert wesentlich ist, damit die Zellstrukturen die Farbstoffe richtig absorbieren können.

Andererseits entwässert der Methanol-Fixierungsschritt die Zellen und der Puffer hilft, sie zu rehydrieren.

Eosin (Y)

Eosin hat eine Affinität zu Bausteinen, da es ein Säurefarbstoff ist. Zwei Arten von Eosin sind einander sehr ähnlich, so dass beide verwendet werden können, um das gleiche Ergebnis zu erzielen.

Eines heißt Eosin Y, gelbes Eosin oder Tetrabromfluorescein, und das andere heißt Eosin B, bläuliches Erythrosin B oder Dibromdinitrofluorescein. Am häufigsten wird jedoch Eosin Y verwendet.

Die wichtigste Eigenschaft dieses Farbstoffs ist seine negative Polarität, wodurch er von positiv geladenen Zellstrukturen angezogen wird.

Methylenblau

Es ist die Grundfarbe. Seine Haupteigenschaft ist die Metachromasie, dh nicht alle Strukturen werden gleich gefärbt, sondern es hängt von der chemischen Zusammensetzung der Strukturen ab, die gefärbt werden.

Einige werden hell oder dunkelblau, andere dunkelviolett oder blass lila.

Technik

1-Führen Sie das Verteilen der Probe so durch, dass ein dünner Film entweder auf einem Objektträger oder einem Deckglas verbleibt.

2-Lassen Sie es ca. 2 Stunden an der Luft trocknen.

3-Legen Sie den trockenen Abstrich mit der Ausbreitung der Probe nach oben auf die Färbebrücke oder die Färbeschale.

4-Decken Sie das Blatt tropfenweise mit dem Wright-Fleck ab, bis die gesamte Oberfläche bedeckt ist. 5 - 8 Minuten einwirken lassen.

5-Der Fleck sollte den Objektträger vollständig bedecken, ohne über die Kanten zu gelangen. Wenn es während der Färbezeit zu verdampfen beginnt, fügen Sie einige zusätzliche Tropfen hinzu.

6-Fügen Sie anschließend eine gleiche Menge des Stoßdämpfers hinzu und blasen Sie ein wenig, bis der charakteristische metallische Glanz erscheint. Zeit 10 bis 15 Minuten.

7-Waschen Sie mit Leitungswasser und platzieren Sie den sanften Strahl, bis das Blatt rosa aussieht.

8-Entfernen Sie mit einer in Alkohol getränkten Gaze den Farbstoff, der auf der Rückseite des Objektträgers haftet.

9-Lassen Sie den Abstrich sehr gut trocknen, bevor Sie das Immersionsöl einsetzen, um es unter dem Mikroskop zu betrachten.

Nützlichkeit

Hämatologie

Es ist ideal zur Färbung von peripheren Blutausstrichen, zur Untersuchung von dicken Blutausstrichen und zur Untersuchung von Zellen aus Knochenmarksproben.

Aufgrund der chemischen Eigenschaften dieser Farbstoffkombination können Zellstrukturen leicht erkannt und die verschiedenen vorhandenen Zelltypen unterschieden werden.

Laufende Nase

Diese Technik ist sehr nützlich, um die Zellen des Nasenausflusses (Epithelzellen, segmentierte Eosinophile, polymorphkernige Zellen) bei der Diagnose einer allergischen Rhinitis zu identifizieren.

Parasitologie

In diesem Sinne war es nützlich für die Untersuchung von Leishmania sp innerhalb der Histiozyten des subkutanen Zellgewebes bei Hautgeschwüren. Ebenso wird es verwendet, um Leukozyten in Stuhlproben zu identifizieren (Stuhlleukogramm).

In diesem Fall ist es für den Arzt von Interesse zu wissen, ob die im Stuhl vorhandene Leukozytose polymorphkernig oder einkernig ist. Dieser Befund im Stuhlleukogramm gibt Aufschluss darüber, ob es sich um eine bakterielle oder eine virale Infektion handelt.

Andererseits können im Blut zirkulierende Parasiten im Erythrozyten oder frei im Plasma gefunden werden. Die gesuchten Parasiten sind Plasmodium spp., Trypanosoma cruzii und Filariae, und in der Veterinärmedizin ist es nützlich bei der Suche nach Theileria equi und Babesia caballi, Erregern der Bebesiose, insbesondere bei Pferden.

Die Wright-Färbung und auch die Giemsa-Färbung ermöglichen es, Hämoparasiten von normalen Zellbestandteilen zu unterscheiden. Hierfür können zwei Arten von Spreads verwendet werden:

Dünn verteilen

Blut wird als dünner Film auf einem Objektträger verteilt. Es ist mit Wright-Färbung gefärbt, wodurch die Eigenschaften des Kerns und des Zytoplasmas sichtbar werden.

Dicker Tropfen

Diese Methode wird verwendet, um das Vorhandensein von Parasiten in einer größeren Menge Blut zu untersuchen.

Dazu wird ein großer Blutstropfen auf einen Objektträger gegeben. Dort muss es defibrilliert werden und mit der Kante eines anderen Objektträgers immer größere Kreise von der Mitte nach außen bilden.

Schließlich müssen die Erythrozyten mit Wasser lysiert werden, um die Parasiten im dicken Abstrich beobachten zu können.

Infektionen der Atemwege

Auf der Ebene der Atemwege ist diese Technik auch nützlich, da die in den Proben von Sputum, Bronchialspülung oder Bronchoalveolar vorhandenen Zellen wichtig sind, um die Diagnose zu stellen.

In ähnlicher Weise können hier polymorphkernige Zellen und mononukleäre Zellen unterschieden werden.

Bakteriologie

Die Verwendung dieser Technik in der Bakteriologie ist begrenzt, da sie nicht zum Färben von Bakterien geeignet ist, weshalb andere spezialisierte Färbetechniken für ihre Färbung verwendet werden.

Es wurde jedoch verwendet, um nach Epithelzellen mit Chlamydia trachomatis-Einschlusskörpern in Harnröhren- oder endozervikalen Schleimhautabstrichen zu suchen, obwohl anerkannt werden muss, dass dies nicht die beste Methode dafür ist.

Es ist auch möglich, spiralförmige Bakterien wie Borrelia burgdorferi unter roten Blutkörperchen bei infizierten Patienten sowie Morulae oder Einschlusskörper von Ehrlichia sp im Zytoplasma von Lymphozyten, Monozyten oder Neutrophilen in einem Blutausstrich zu beobachten.

Pilzkunde

Histoplasma capsulatum ist ein pathogener Pilz, der häufig durch mikroskopische Beobachtung verschiedener mit Wright-Färbung gefärbter Gewebeproben diagnostiziert wird.

Wie werden die Strukturen der Blutprobe mit der Wright-Färbung beobachtet?

Quelle: Retamales E, Mazo V. Institut für öffentliche Gesundheit, Regierung von Chile. Empfehlungen zur Färbung von Blutausstrichen zum Ablesen des Hämogramms.

Empfehlungen für eine gute Färbung

Blutprobenobjektträger sollten spontan an der Luft trocknen. Die Abstriche sollten so dünn wie möglich sein, um eine bessere Fixierung des Farbstoffs zu erzielen und eine Überfärbung zu vermeiden.

Für eine qualitativ hochwertige Färbung ist es ratsam, innerhalb von zwei Stunden nach der Abstrichvorbereitung zu färben. Andererseits ist Kapillarblut ohne Antikoagulans die ideale Probe.

Wenn jedoch venöses Blut verwendet wird, sollte es als Antikoagulans EDTA und nicht als Heparin verwendet werden, da letzteres die Zellstrukturen deformieren kann.

Um eine Verschlechterung des vorbereiteten Farbstoffs zu vermeiden, sollte es an trockenen Orten gelagert werden.

Während des Waschvorgangs wird die Verwendung von Wasser empfohlen, das auf einen neutralen pH-Wert eingestellt ist.

Schließlich ist es ratsam, von Zeit zu Zeit die im Labor verwendeten Färbemethoden zu testen.

Dies erfolgt durch Färben von Proben oder erweiterten Mustern als Qualitätskontrolle. Dieser Schritt ist wichtig, da er sicherstellt, dass die Färbung richtig vorbereitet ist und die Färbezeiten gut standardisiert sind.

Wenn das Musterblatt schlecht gefärbt ist, müssen Probleme gelöst werden.

Häufige Fehler bei der Wright-Färbung

Sehr blasse Färbung

Sehr blasse Abstriche sind normalerweise auf eine sehr kurze Färbezeit oder übermäßiges Waschen zurückzuführen. Sie wird korrigiert, indem die Kontaktzeit mit dem Farbstoff verlängert oder die Waschzeit verkürzt wird.

Farbstoff fällt aus

Das Vorhandensein von Farbstoffniederschlägen im Abstrich kann mehrere Ursachen haben. Die häufigsten Ursachen sind jedoch: Verwendung von ungefiltertem Farbstoff, Verfärbung auf unebenen Färbebrücken, Verwendung von mit Staub oder Fett verschmutzten Folien, keine gute Wäsche, wenn vollständige Färbung.

Extrem roter oder blauer Abstrich

Der Puffer ist für den pH-Wert des Farbstoffs verantwortlich. Farbstoffe mit einem pH-Wert unter dem angegebenen (sauer) führen zu sehr rötlichen Abstrichen.

Wenn der pH-Wert des Farbstoffs über (alkalisch) liegt, wird ein extrem bläulicher Abstrich erhalten.

Speichermodus

Das Reagenz sollte bei Raumtemperatur gelagert werden.

Verweise

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