KATALASETEST: BEGRÜNDUNG, TECHNIK UND VERWENDUNG - BIOLOGIE - 2025

Der Katalasetest ist eine Methode, die in bakteriologischen Labors verwendet wird, um das Vorhandensein des Enzyms Katalase in den Bakterien, die es besitzen, aufzudecken. Zusammen mit der Gram-Färbung sind sie die Haupttests, die an neu isolierten Mikroorganismen durchgeführt werden sollten. Diese Tests führen den Mikrobiologen zu den Schritten, die zur endgültigen Identifizierung des betreffenden Mikroorganismus zu befolgen sind.

Im Allgemeinen besitzen Bakterien, die Cytochrom enthalten, das Enzym Katalase, was bedeutet, dass fakultative aerobe und anaerobe Bakterien es besitzen sollten. Es gibt jedoch Ausnahmen wie Streptococcus, die, obwohl sie fakultative anaerobe Mikroorganismen sind, das Enzym Katalase nicht besitzen.

Ausführen des Katalasetests mit positiver Reaktion. Quelle: Kein maschinenlesbarer Autor angegeben. Nase angenommen (basierend auf urheberrechtlichen Ansprüchen).

Aus diesem Grund wird der Katalasetest hauptsächlich verwendet, um die Staphylococaceae- und Micrococaceae-Familien (beide Katalase-positiv) von der Streptococaceae-Familie (Katalase-negativ) zu unterscheiden.

Ebenso unterscheidet sich die Gattung Bacillus (Katalase positiv) unter anderem von der Gattung Clostridium (Katalase negativ).

Basis

Katalase ist ein Enzym, das als Hydroperoxidase klassifiziert ist. Dies bedeutet, dass sie Wasserstoffperoxid (H ₂ O ₂ ) als Substrat verwenden .

Es wird auch als Oxidoreduktase angesehen, da bei der Reaktion, an der es beteiligt ist, ein Element als Elektronendonor (reduzierende Substanz) und ein anderes als Elektronenrezeptor (oxidierende Substanz) dient.

Katalase ist ein Protein, das eine proserische Gruppe mit vier dreiwertigen Eisenatomen (Fe ⁺⁺⁺ ) enthält, daher ist es ein Homoprotein. Das Eisenion bleibt während der Reaktion oxidiert.

Man kann sagen, dass Katalase ein entgiftendes Enzym ist, da seine Funktion darin besteht, Substanzen zu eliminieren, die während des bakteriellen Metabolismus produziert werden und für Bakterien toxisch sind. Zu diesen Substanzen gehört Wasserstoffperoxid.

Wasserstoffperoxid entsteht beim aeroben Abbau von Zuckern. Dieser Vorgang läuft wie folgt ab:

Das Superoxidion (O ₂ ^- ) (freies Radikal) wird als Endprodukt der aeroben Assimilation von Glucose gebildet. Dies ist toxisch und wird durch das Enzym Superoxiddismutase eliminiert, das es in gasförmigen Sauerstoff und Wasserstoffperoxid umwandelt.

Wasserstoffperoxid ist auch für Bakterien giftig und muss entfernt werden. Das Enzym Katalase zerlegt Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff.

Katalase kann auf andere Substrate als Wasserstoffperoxid wie Alkohole, Aldehyde, Säuren, aromatische Amine und Phenole einwirken. Wasserstoffperoxid kann jedoch auch von Katalase verwendet werden, um andere toxische Verbindungen wie Methyl- und Ethylalkohol zu oxidieren.

Ebenso ist Katalase in phagozytischen Zellen vorhanden und schützt sie vor der toxischen Wirkung von Wasserstoffperoxid.

Routinetechnik für den Katalasetest

-Slide-Methode

Materialien

3% Wasserstoffperoxid (10 Volumina).

Mikroskop-Objektträger

Einweg-Kunststoffgriff oder Holzzahnstocher.

Prozess

Nehmen Sie genug von der Kolonie, um zu studieren, ohne den Agar zu berühren, von dem sie stammt. Die Kolonie muss frisch sein, dh aus einer Kultur von 18 bis 24 Stunden.

Legen Sie die Kolonie auf den trockenen Objektträger und geben Sie einen Tropfen 3% iges Wasserstoffperoxid hinzu ( 30% H ₂ O ₂ können ebenfalls verwendet werden ). Beobachten Sie sofort, ob Blasen freigesetzt werden oder nicht.

Deutung

Positive Reaktion: Gasentwicklung, nachgewiesen durch Blasenbildung (starke Blasenbildung).

Negative Reaktion: keine Blasenbildung.

-Direkte Methode in Reinkultur

1 ml 3% H ₂ O ₂ auf eine reine Platte oder Keilkultur geben, die kein Blut enthält (vorzugsweise Nähragar). Beobachten Sie sofort, ob sich Blasen bilden. 30% H ₂ O ₂ können ebenfalls verwendet werden .

Es wird genauso interpretiert wie die Porta-Objektmethode.

-Methode mit Kapillarröhrchen oder Fung und Petrishko

Füllen Sie ein 67 mm Kapillarröhrchen bis zu einer Höhe von 20 mm mit 3% Wasserstoffperoxid durch Kapillarität.

Berühren Sie die zu untersuchende isolierte Kolonie mit der mit 3% H ₂ O ₂ gefüllten Kapillare _. Beobachten Sie, ob sich die Kapillare in ca. 10 Sekunden mit Blasen füllt. Diese Methode ermöglicht die Halbquantifizierung der Reaktion in Kreuzen:

Ohne Kreuze gibt es keine Blasen (negative Reaktion).

+ ---- Wenige Blasen (schwache oder verzögerte Reaktion).

++ --– Reichlich vorhandene Blasen (mäßige Reaktion).

+++ - Blasen erreichen das andere Ende (starke Reaktion).

-Taylor- und Achanzar-Methode für Katalasetests, die fragwürdig sind

Legen Sie eine isolierte Kolonie auf einen sauberen, trockenen Objektträger, geben Sie dann einen Tropfen 0,5% H ₂ O ₂ und bedecken Sie ihn mit einem Deckglas. Beobachten Sie, ob sich eingeschlossene Blasen bilden oder nicht.

Interpretation: Das Vorhandensein von Blasen zeigt eine positive Reaktion an. Keine Blasen, es wird als negative Reaktion interpretiert.

Katalasetest für Mycobacterium-Arten

Diese Technik muss durch Steuern des pH-Werts und der Temperatur durchgeführt werden. Es muss unter einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, da die Manipulation der verschiedenen Mycobacterium-Arten gefährlich ist.

-Materialien

Wasserstoffperoxid 30% oder 110 Volumina (Superoxal).

Phosphatpuffer pH 7

10% Tween 80

Mycobacterium-Keilkultur für 3 bis 4 Wochen

-Vorbereitung

Phosphatpuffer pH 7

Wiegen:

1,361 g wasserfreies Monokaliumphosphat (KH ₂ PO ₄ ).

1,420 g wasserfreies Dinatriumphosphat (Na 2 HPO 3).

Beide Salze in etwas sterilem destilliertem Wasser lösen und mit Wasser auf 1000 ml auffüllen.

10% Tween 80

Führen Sie eine 1:10 Verdünnung des kommerziell konzentrierten Tween 80 durch. Gehen Sie dazu wie folgt vor:

Nehmen Sie 1 ml Tween 80 und legen Sie es in etwas destilliertes Wasser, lösen Sie es auf und füllen Sie das Volumen mit Wasser auf 10 ml auf.

Endreagenz

Mischen Sie eine Menge Phosphatpuffer mit einer Menge von 10% Tween 80 (gleiche Teile). Definieren Sie im Labor, wie viel Sie vorbereiten möchten.

-Prozess

5 ml Phosphatpuffer in ein steriles Reagenzglas mit Schraubverschluss (Bakelit) geben.

Nehmen Sie mit einer Inokulationsschleife genügend Kolonie eines Mycobacterium-Wachstums, das in Keilen ausgesät ist, und lösen Sie sich im Phosphatpuffer auf.

Verschließen Sie das Rohr, ohne das Gewinde zu fest anzuziehen. 20 bis 30 Minuten in ein Wasserbad bei 68 ° C stellen. Herausnehmen und auf 22-25 ° C abkühlen lassen

Messen Sie 0,5 ml des endgültigen Reagenzes (mischen) und geben Sie es mit der kalten Lösung in das Röhrchen. Beobachten Sie die Bildung von Blasen oder nicht.

Es wird genauso interpretiert wie die vorherigen Techniken.

Verwenden

Wenn das Koloniewachstum in angereicherten Medien erhalten wird, sollten eine Gram-Färbung und ein Katalasetest an den erhaltenen Kolonien durchgeführt werden. Dies wird den Mikrobiologen zu den Verfahren führen, die zur endgültigen Identifizierung zu befolgen sind.

Quelle: Erstellt vom Autor MSc. Marielsa Gil

QA

Um die gute Leistung des Wasserstoffperoxid-Reagens zu bewerten, verwenden Sie frisch kultivierte Kontrollstämme wie Staphylococcus aureus als Positivkontrolle und Streptococcus sp-Stämme als Negativkontrolle.

Eine andere Alternative, die als positive Kontrolle dient, besteht darin, einen Tropfen Wasserstoffperoxid auf den Blutagar zu geben. Die Erythrozyten haben Katalase. Wenn das Reagenz in gutem Zustand ist, kommt es daher zu Blasenbildung.

Ein Schokoladenagar kann als Negativkontrolle verwendet werden, hier sind die Erythrozyten bereits lysiert und der Test ist negativ.

Einschränkungen

- Verwenden Sie keine alten Kulturen für den Test, da dies zu falsch negativen Ergebnissen führen kann.

- Vermeiden Sie die Entnahme von Kolonien aus Kulturen auf Blutagar, wenn Sie darauf achten, den Agar nicht zu berühren. Dieses Verfahren kann zu falsch positiven Ergebnissen führen, da rote Blutkörperchen Katalase enthalten.

-Wenn Sie die Kolonie mit einem Platingriff nehmen, kehren Sie die Reihenfolge des Verfahrens nicht um, da dies zu falsch positiven Ergebnissen führen kann. Dies liegt daran, dass Platin mit Wasserstoffperoxid reagieren kann und ein Blasen verursacht.

- Verwenden Sie das Wasserstoffperoxid-Reagenz nicht, wenn es sehr alt ist, da das Reagenz sehr instabil ist und sich mit der Zeit zersetzt.

- Bewahren Sie das Wasserstoffperoxid-Reagenz vor Licht geschützt und gekühlt auf, um Beschädigungen zu vermeiden.

- Führen Sie bei jeder Verwendung eine Qualitätskontrolle des Wasserstoffperoxid-Reagens durch.

- Berücksichtigen Sie, dass bei Verwendung von 30% H ₂ O ₂ die Reaktionen stärker sind als bei 3% H ₂ O ₂ .

Verweise

1. Koneman E., Allen S., Janda W., Schreckenberger P., Winn W. (2004). Mikrobiologische Diagnose. 5. Aufl. Editorial Panamericana SA Argentinien.
2. Forbes B., Sahm D., Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Mikrobiologische Diagnose. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentinien.
3. Mac Faddin J. (2003). Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien von klinischer Bedeutung. 3rd ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentinien.
4. BD Laboratories. Katalase-Gotario-Reagenz. Verfügbar unter: http://winklerltda.cl
5. Vadequímica Laboratories. Peroxid. Äquivalenz zwischen Volumen und Prozentsatz. Verfügbar unter: vadequimica.com