PROTEINASE K: EIGENSCHAFTEN, ENZYMATISCHE AKTIVITÄT, ANWENDUNGEN - BIOLOGIE - 2025

Die K-Proteinase ist ein Enzym, das zur Gruppe der Serinproteasen gehört, dh sie hat in ihrer Mitte eine katalytisch aktive Aminosäure Serin und hat die Funktion, die Peptidbindungen durch Hydrolyse aufzubrechen. Dieses Enzym gehört wiederum zur Familie der Subtilisin-Proteine ​​(Peptidase S8).

Proteinase K hat ein Molekulargewicht (MW) von 28.900 Dalton und wurde erstmals 1974 in Extrakten des Pilzes Engyodontium album, früher bekannt als Tritirachium album Limber, isoliert.

Molekülstruktur der Proteinase K. Quelle: Lykchiniadis

Es hat eine hohe proteolytische Kapazität, was sich darin zeigt, dass es das im Haar vorhandene Keratin abbauen kann. Das Wort Keratin im Englischen wird "Keratin" geschrieben, daher wurde es "Proteinase K" genannt.

Aufgrund seiner hohen Fähigkeit, native Proteine ​​zu spalten, ist dieses Enzym in verschiedenen molekularbiologischen Techniken nützlich. Es wird hauptsächlich zur Isolierung und Herstellung von Nukleinsäuren mit hohem Molekulargewicht (MW) verwendet.

Proteinase K setzt Kern-DNA frei, zerstört Proteine ​​und inaktiviert RNasen und DNasen, dh es eliminiert Nukleasen in DNA- und RNA-Präparaten.

Andererseits wurde festgestellt, dass Proteinase K einige denaturierte native Proteine ​​hydrolysieren kann, was das Interesse der Forscher für ihre Verwendung bei der Untersuchung von Prionproteinen (PrPC) geweckt hat.

Trotz ihrer hohen proteolytischen Wirksamkeit gibt es Proteine, die gegen die Wirkung von Proteinase K resistent sind. Unter diesen befinden sich einige abnormale Proteine, sogenannte Prionen (PrPSc), die mit übertragbaren spongiformen Enzephalopathien assoziiert sind.

Proteinase K Eigenschaften

Proteinase K hat eine Tertiärstruktur, die aus drei Schichten besteht, wobei ein siebenkettiges β-Faltblatt zwischen zwei Schichten von Helices angeordnet ist. Da es zur S8-Familie der Peptidasen gehört, zeichnet es sich durch eine katalytische Triade im aktiven Zentrum aus, deren sequentielle Reihenfolge (Asp, His und Ser) ist, wodurch sie sich von anderen Peptidase-Familien unterscheiden.

Dieses Enzym aus der Gruppe der Serinproteasen ist durch Hydrolyse der Peptidbindungen nahe der Carboxylgruppe der aliphatischen und aromatischen Aminosäuren gekennzeichnet.

Andererseits ist es in der Lage, in Gegenwart bestimmter ätzender Substanzen wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Tris-HCL und EDTA zu wirken, die zur Denaturierung von Proteinen beitragen und deren native Struktur verlieren.

Dies ist ein erster Schritt bei der Herstellung von Proteinen für die Elektrophoresetechnik. Der pH-Bereich, in dem Proteinase K wirkt, ist ziemlich breit (2,0 bis 12,0), mit einem optimalen pH zwischen 7,5 und 12,0 und einem isoelektrischen Punkt von 8,9. Wie zu sehen ist, ist es gegen einen sehr weiten pH-Bereich aktiv.

Ein weiteres Merkmal, das bei Proteinase K auffällt, ist seine Stabilität bei hohen Temperaturen (50 - 60 ° C).

Enzymatische Aktivität

Proteinase K erfordert die Anwesenheit des Calciumions, obwohl dies seine Aktivität nicht beeinflusst, wenn es wesentlich ist, seine Stabilität aufrechtzuerhalten.

Damit Proteinase K das Substrat vollständig verdaut, ist eine Kontaktzeit von ungefähr 5 Minuten bis 2 Stunden erforderlich.

In diesem Sinne verglichen Daza et al. Die Reinheit der DNA, die zu verschiedenen Zeitpunkten der Exposition gegen Proteinase K erhalten wurde, und kamen zu dem Schluss, dass eine längere Inkubation (bis zu 24 Stunden) die Qualität der DNA signifikant verbessert.

In Bezug auf die Konzentration des Proteinase K-Enzyms, das in den verschiedenen Protokollen verwendet wird, kann jedoch gesagt werden, dass es sehr unterschiedlich ist.

Es kann von sehr niedrigen Konzentrationen (5 µg / ml) bis zu Konzentrationen von 500 µg / ml verwendet werden. Die häufigsten Arbeitskonzentrationen liegen jedoch zwischen 50 und 100 μg / ml, insbesondere für die Proteinverdauung und die Inaktivierung von Nukleasen. Obwohl für die Behandlung von Geweben eine Konzentration von 2 mg / ml erforderlich ist.

Anwendungen

Seine Anwendungen sind sehr breit und können wie folgt zusammengefasst werden:

-Es wird bei der Verdauung von Proteinen und der DNA-Extraktion durch verschiedene Methoden verwendet, wie zum Beispiel: Aussalzen, PK-SDS, Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), modifiziertes Kaliumacetat und Extraktion mit Natriumiodid.

-Inaktivierung von Nukleasen (RNasen und DNasen).

-In der In-situ-Hybridisierungstechnik (HIS), um die Freisetzung von Nukleinsäure zu unterstützen und unerwünschte Proteine ​​zu eliminieren.

-Modifikation von Proteinen.

-Auf der Forschungsstufe in verschiedenen Studien.

Vorteile der Proteinase K.

Es wurden mehrere Vergleichsstudien zwischen DNA-Extraktionstechniken durchgeführt, die Proteinase K verwenden, und anderen, die es nicht verwenden, und alle kommen zu dem Schluss, dass die Verwendung des Enzyms größere Vorteile bietet. Zu den Vorteilen gehören:

Man erhält eine DNA mit hohem Molekulargewicht, hoher Qualität und Reinheit.

-Die extrahierte DNA ist bis zu 3 Monate stabil.

Die extrahierte DNA kann in den folgenden Techniken verwendet werden: Southern Blot, Polymerasekettenreaktion (PCR), Elektrophorese, unter anderem.

Proteinase K-resistente Proteine

Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, dass sich Prionen (abnormale toxische PrPSc-Proteine) von PrPC (nativen) Proteinen dadurch unterscheiden, dass sie gegen die Wirkung von Proteinase K resistent sind, während PrPCs gegenüber ihrer Wirkung empfindlich sind.

Andere Autoren haben beschrieben, dass es in der Struktur von PrPSc empfindliche Teile gibt und andere, die gegen Proteinase K resistent sind. Beide Teile sind jedoch gleichermaßen toxisch und infektiös.

Andererseits isolierten Bastian et al. 1987 4 Proteine ​​mit 28, 30, 66 und 76 kda aus einer Art von Spiroplasma mirum. Alle erwiesen sich als resistent gegen die Wirkung von Proteinase K und zeigten auch eine Kreuzreaktion mit einigen Prionen.

Es ist bekannt, dass diese Art Katarakte und erhebliche neurologische Schäden verursachen kann. Aufgrund von Bastians wissenschaftlichen Erkenntnissen wurde unter anderem versucht, diesen Mikroorganismus mit übertragbaren spongiformen Enzephalopathien in Verbindung zu bringen.

Die Ätiologie dieser degenerativen neurologischen Pathologie wird jedoch auch heute noch Prionen zugeschrieben.

In diesem Sinne identifizierten und charakterisierten Butler et al. 1991 eine gegen Proteinase K resistente Proteinklasse von 40 kda aus zwei Stämmen von Mycoplasma hyorhinis. Dieser Erreger befällt Schweine und infiziert deren Gewebe. In diesem Fall trat jedoch keine Kreuzreaktion mit den getesteten Prionen auf.

Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um viele Unbekannte in dieser Hinsicht aufzuklären.

Verweise

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