LÖWENSTEIN-JENSEN-MEDIUM: GRUNDIERUNG, VORBEREITUNG UND VERWENDUNG - BIOLOGIE - 2025

Das Löwenstein-Jensen- Medium ist ein selektives festes Medium zur Isolierung und Entwicklung von Bakterien der Gattung Mycobacterium, wie z. B. Mycobacterium tuberculosis, M. avium, mit Ausnahme der nicht kultivierbaren Leprae-Arten.

Bakterien der Gattung Mycobacterium wachsen nicht in herkömmlichen Kulturmedien, daher war es notwendig, ein spezielles Medium für ihre Isolierung zu entwerfen. Das ursprüngliche Medium wurde von Löwenstein erstellt und später von Jensen modifiziert.

Löwenstein-Jensen-Medium mit Kolonien von Mycobacterium tuberculosis. Quelle: Agarwal et al. / BioMed Central Ltd., mit freundlicher Genehmigung der Biology Image Library

Die Modifikation bestand in der Eliminierung des Kongo-Rot-Farbstoffs, wobei dieser durch eine höhere Konzentration an Malachitgrün ersetzt wurde. Es veränderte auch die Konzentrationen von Magnesiumcitrat und Monokaliumphosphat.

Löwenstein-Jensen-Medium enthält derzeit Kartoffelstärke, Asparagin, Magnesiumcitrat, Monokaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Malachitgrün, Nalidixinsäure, Cycloheximid, Lincomycin, geschlagene Eier, Glycerin und Wasser.

Mykobakterien werden normalerweise aus nicht sterilen Stellen wie Sputum, Urin und Abszessen isoliert. Dies bedeutet, dass die meisten Proben die üblichen Mikrobiota des Gebiets sowie den Erreger enthalten.

Deshalb enthält das Löwenstein-Jensen-Medium in seiner Zusammensetzung eine Reihe von Inhibitoren, die durch Malachitgrün, Antibiotika und Antimykotika dargestellt werden.

Außerdem müssen Proben, die von nicht sterilen Stellen stammen, dekontaminiert und neutralisiert werden, bevor sie in das Löwenstein-Jensen-Medium ausgesät werden.

Basis

Das Vorhandensein von Ei und Glycerin im Löwenstein-Jensen-Medium stimuliert das Wachstum von Mykobakterien, da sie die für die Entwicklung dieser Mikroorganismen erforderlichen Fettsäuren und Proteine ​​liefern.

Das Löwenstein-Jensen-Medium enthält Malachitgrün, das die begleitende Mikrobiota hemmt. Es enthält aber auch Nalidixinsäure (35 µg / ml), die die gramnegativen Mikrobiota hemmt, Cycloheximid (400 µg / ml), das saprophytische Pilze und Hefen hemmt, und Lincomycin (2 µ / ml), das die grampositiven Mikrobiota hemmt.

Einige Handelshäuser bevorzugen die Zugabe der folgenden Kombination von Antibiotika: Polymyxin B 200.000 Einheiten / l, Amphotericin B 10 mg / l, Carbenicillin 50 mg / l und Trimethoprim 10 mg / l.

Dieses Medium enthält keinen Agar, daher erfolgt die Verfestigung des Mediums aufgrund der Koagulation des im Ei vorhandenen Albumins während der Sterilisation.

Vorbereitung

37,3 g des dehydrierten Mediums werden in 600 ml destilliertem Wasser gewogen, zu dem zuvor 12 ml Glycerin gegeben wurden. Die Mischung wird unter häufigem Rühren erhitzt, bis sie vollständig aufgelöst ist. Das Medium 15 Minuten bei 121 ° C autoklavieren.

Andererseits sollte unter aseptischen Bedingungen eine homogene Suspension von 1000 ml frischen Eiern hergestellt werden. Die Eiersuspension zu den 600 ml Medium geben, das bei einer Temperatur von 50 - 60 ° C hergestellt wurde, wobei Luftblasen vermieden werden.

Antibiotika-Lösungen werden auch nach Sterilisation im Autoklaven zugegeben.

Gießen Sie das Medium in sterile Reagenzgläser mit Schraubverschluss. Erhitzen Sie die Röhrchen 45 Minuten lang in geneigter Position auf 85 ° C.

Die Farbe des hergestellten Mediums ist aquamaringrün und kann aufgrund des Vorhandenseins von Eilipiden weißliche Flecken aufweisen.

Der pH-Wert des Mediums muss 7,2 ± 0,2 betragen

Bewahren Sie die Röhrchen im Kühlschrank auf und schützen Sie sie bis zur Verwendung vor direktem Licht. Vor der Aussaat temperieren.

Es gibt eine Modifikation des Mediums "Gruft-Modifikation des Löwenstein Jensen". Dieses enthält die gleichen Verbindungen wie das klassische Medium, jedoch wird RNA-5 mg / 100 ml zugesetzt, und als Inhibitoren enthält es Malachitgrün 0,025 g / 100 ml, Penicillin 50 U / ml und Nalidixinsäure 35 ug / ml.

Anwendungen

Löwenstein-Jensen-Medium wird zur Isolierung von Mykobakterien aus verschiedenen Probentypen verwendet. Eine Ziehl-Neelsen-Färbung wird für alle Proben empfohlen, bei denen der Verdacht auf Mykobakterien besteht.

Einige Proben stammen von sterilen Stellen, andere nicht. Nicht sterile Proben müssen gegebenenfalls dekontaminiert werden:

Sputum

Sputumproben sollten wie folgt dekontaminiert werden: Bestimmen Sie die Menge der Sputumprobe in ml und geben Sie die gleiche Menge 4% iger NaOH in die Probe und inkubieren Sie bei 37 ° C.

Schütteln Sie die Mischung häufig innerhalb von 30 Minuten. Anschließend 30 Minuten bei 3000 U / min zentrifugieren.

Verwerfen Sie den Überstand über einer phenolischen Desinfektionslösung. Verwenden Sie das Sediment zur Aussaat, aber zuerst muss der pH-Wert neutralisiert werden.

Um das Sediment zu neutralisieren, wird 5% H ₂ SO ₄ in Gegenwart des Phenolrot-Indikators verwendet, bis ein neutraler pH-Wert erreicht ist, der eine Lachsfarbe erzeugt.

Magenspülung, Bronchialspülung und Bronchialaspiration

In diesem Fall muss die Probe 30 Minuten bei 3000 U / min zentrifugiert werden. Der Überstand wird verworfen und das Pellet verwendet. Um das Sediment zu dekontaminieren, fügen Sie 3 ml 4% iges NaOH hinzu und rühren Sie häufig eine halbe Stunde lang bei 37 ° C.

Erneut zentrifugieren, der Überstand wird verworfen und das Pellet wird verwendet. Letzteres muss wie in der Sputumprobe erläutert neutralisiert werden.

Urin

Lassen Sie die Probe 24 Stunden im Kühlschrank ruhen. Trenne den Überstand ab. Das verbleibende Pellet sollte 30 Minuten bei 3000 U / min zentrifugiert werden. Verwerfen Sie den Überstand erneut und rekonstituieren Sie das Pellet mit 3 ml steriler physiologischer Lösung.

3 ml 4% iges NaOH zugeben und wie zuvor beschrieben dekontaminieren und neutralisieren.

Aszitesflüssigkeit, Pleuraflüssigkeit, Liquor cerebrospinalis

Bei diesem Probentyp wird es zentrifugiert und der Überstand verworfen. Führen Sie ein Gramm am Sediment durch oder beobachten Sie es direkt unter dem Mikroskop. Wenn keine Bakterien beobachtet werden, ist weder der Dekontaminationsschritt noch der Neutralisationsschritt erforderlich.

In diesem Fall kann die Probe direkt mit dem Sediment ausgesät werden. Wenn Bakterien vorhanden sind, dekontaminieren und neutralisieren Sie wie oben beschrieben.

Biopsien

Zu dieser Art von Probe müssen 5 ml destilliertes Wasser zu einer späteren Zentrifuge bei 1500 U / min für 10 Minuten gegeben werden. Verwerfen Sie den Überstand und zentrifugieren Sie das Pellet erneut 30 Minuten lang bei 3500 U / min. Verwenden Sie das Sediment, um das Kulturmedium zu säen.

Kehlkopfabstrich

Der Tupfer sollte in ein steriles Röhrchen gegeben werden, das zu gleichen Teilen destilliertes Wasser und 4% NaOH enthält. Der Tupfer muss gegen die Wände des Röhrchens gedrückt werden, damit die Probe in der Flüssigkeit verdünnt wird. Zentrifugieren und das Sediment verwenden. Neutralisieren Sie das Sediment wie bereits beschrieben.

Gesät

Das Löwenstein-Jensen-Medium wird durch Zugabe von 0,5 ml der Probe auf die Oberfläche des Mediums beimpft. Drehen Sie das Röhrchen, um die Probe im gesamten Medium zu verteilen. Verwenden Sie keinen Platingriff.

Ein zweites Röhrchen, das Stonebrink-Medium enthält, kann ausgesät werden, um Mycobacterium bovis und andere Arten zu isolieren, die nicht auf Löwenstein-Jensen-Medium wachsen.

Inkubation

Die beimpften Röhrchen werden aerob bei 37 ° C inkubiert, wobei die Kappe leicht locker und um ca. 5 ° geneigt und vor Licht geschützt ist. Die Umwelt kann mit 5–10% Kohlendioxid angereichert werden. Überprüfen Sie die Kulturen zweimal pro Woche, bis Kolonien erscheinen.

Wenn die Probe absorbiert wurde, werden die Kappen festgezogen. Die maximale Inkubationszeit beträgt 8 Wochen. Wenn nach dieser Zeit kein Wachstum mehr auftritt, wird dies als negativ gemeldet.

QA

Die folgenden Stämme können als Qualitätskontrolle verwendet werden:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus 320 von AT

Für die ersten drei genannten Arten wird eine hervorragende Entwicklung erwartet, da das Wachstum von M. fortuitum gut sein sollte, während für M. bovis nur ein geringes oder gar kein Wachstum erwartet wird. In der Zwischenzeit müssen andere Arten als die Gattung Mycobacterium vollständig gehemmt werden.

Einschränkungen

Das vorbereitete Medium muss vor Licht geschützt werden. Bei längerer Belichtung wechselt das Medium von grün nach blau. In diesem Fall kann das Medium nicht mehr verwendet werden. Dies liegt daran, dass Malachitgrün lichtempfindlich ist.

Das Medium, da es Eier enthält, kann leicht kontaminiert werden, wenn es nicht aseptisch behandelt wird. Es kann aufgelöst werden, wenn es mit proteolytischen Bakterien kontaminiert wird.

Die Kultivierung und Handhabung von Bakterien der Gattung Mycobacterium erfordert qualifiziertes Personal, das sich der Biosicherheitsmaßnahmen bewusst ist, die befolgt werden müssen, um eine Kontamination oder Kontamination anderer zu vermeiden.

HCl sollte wegen der Bildung von Natriumchlorid, das für Kochs Bazillus toxisch sein kann, nicht im Neutralisationsschritt verwendet werden.

Die Proben sollten gekühlt und vor Licht geschützt aufbewahrt werden, während sie nicht verarbeitet werden.

Referenz

1. Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Löwenstein-Jensen-Selektionsmedium. Verfügbar unter: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen Medium. Verfügbar unter: britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen-Medium. Verfügbar unter: Foodsafety.neogen.com.
4. "Löwenstein-Jensen-Medium." Wikipedia, die freie Enzyklopädie. 20. November 2018, 15:15 UTC. 24. April 2019, 18:34 Uhr. wikipedia.org
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