MEDIO VON: BEGRÜNDUNG, VORBEREITUNG, VERWENDUNG UND EINSCHRÄNKUNGEN - BIOLOGIE - 2025

Das OF- oder Glucose-Fermentationsmedium ist ein halbfester Agar, der speziell für die Untersuchung des oxidativen und fermentativen Metabolismus von Kohlenhydraten in einer wichtigen Gruppe anderer Mikroorganismen als Enterobacteriaceae entwickelt wurde, die als nicht-enterische gramnegative Bazillen bezeichnet werden.

Es wurde von Hugh und Leifson erstellt; Diese Forscher stellten fest, dass herkömmliche Methoden zur Untersuchung der Säureproduktion aus Kohlenhydraten für diese spezifische Gruppe von Bakterien nicht geeignet waren.

A. Kommerzielles basales OF-Medium. B. Röhrchen mit OF-Medium ausgesät. Quelle: A und B Fotos des Autors MSc. Marielsa Gil.

Dies liegt daran, dass nicht-enterische gramnegative Stäbchen im Gegensatz zu Enterobacteriaceae im Allgemeinen geringe Mengen an Säuren produzieren.

In diesem Sinne weist das OF-Medium spezielle Eigenschaften auf, die die geringen Mengen an gebildeter Säure sowohl auf oxidativem als auch auf fermentativem Weg nachweisen können. Diese Unterschiede hängen mit der Menge an Peptonen, Kohlenhydraten und Agar zusammen.

Dieses Medium enthält weniger Peptonen und eine höhere Konzentration an Kohlenhydraten, wodurch die Produkte reduziert werden, die das Medium infolge des Proteinstoffwechsels alkalisieren, und die Produktion von Säuren aufgrund der Verwendung von Kohlenhydraten erhöht wird.

Andererseits begünstigt die Abnahme der Agarmenge die Verbreitung der im gesamten Medium produzierten Säure und ermöglicht es uns, die Motilität zu beobachten.

Das OF-Medium besteht aus Pepton, Natriumchlorid, Bromthymolblau, Dikaliumphosphat, Agar und einem Kohlenhydrat. Das häufigste Kohlenhydrat ist Glukose, aber es können auch andere verwendet werden, nach denen man studieren möchte, wie beispielsweise Laktose, Maltose, Xylose.

Basis

Wie jedes Kulturmedium muss das OF-Medium Nährstoffe enthalten, die das Bakterienwachstum gewährleisten. Diese Substanzen sind Peptonen.

Das Kohlenhydrat liefert seinerseits Energie und dient gleichzeitig dazu, das Verhalten des Mikroorganismus gegen ihn zu untersuchen, dh die Bakterien können als oxidativer, fermentativer oder nicht saccharolytischer Organismus eingestuft werden.

OF-Medium enthält ein Pepton / Kohlenhydrat-Verhältnis von 1: 5 im Gegensatz zu herkömmlichen Medien von 2: 1. Dies stellt sicher, dass die Menge an alkalischen Aminen, die beim Abbau von Peptonen gebildet wird, die Bildung schwacher Säuren nicht neutralisiert.

Andererseits enthält das Medium Natriumchlorid und Dikaliumphosphat. Diese Verbindungen stabilisieren das Medium osmotisch und regulieren den pH-Wert. Bromthymolblau ist der pH-Indikator, der die Farbe des Mediums unter Bildung von Säure von grün nach gelb ändert.

Einige Mikroorganismen können Kohlenhydrate auf oxidativem oder fermentativem Weg verwenden, während andere keinen der beiden Wege einschlagen.

Dies hängt von den Eigenschaften jedes Mikroorganismus ab. Beispielsweise können einige strenge aerobe Mikroorganismen bestimmte Kohlenhydrate oxidieren, und fakultative Anaerobier können je nach Umgebung oxidieren und fermentieren, während andere Kohlenhydrate (asacarolytisch) nicht oxidieren oder fermentieren.

Schließlich gibt es eine von der CDC empfohlene Modifikation des OF-Mediums, die eine spezielle OF-Base mit Phenolrot als Indikator enthält.

Oxidationsprozess

Der Glucoseoxidationsprozess erfordert nicht die Phosphorylierung von Glucose, ebenso wie der Fermentationsprozess. In diesem Fall wird die Aldehydgruppe zu einer Carboxylgruppe oxidiert, was zu Gluconsäure führt. Dies wird wiederum zu 2-Ketoglucon oxidiert.

Letzteres reichert sich entweder an oder zerfällt in zwei Brenztraubensäuremoleküle. Dieses System erfordert die Anwesenheit von Sauerstoff oder einer anorganischen Verbindung als endgültigem Elektronenakzeptor.

Die Produktion von Säuren auf diesem Weg ist schwächer als die auf dem Fermentationsweg erhaltene.

Fermentationsprozess

Damit die Glukosefermentation auf einem der verfügbaren Wege erfolgen kann, muss sie zuerst phosphoryliert werden und zu Glukose-6-phosphat werden.

Die Glukosefermentation kann auf mehreren Wegen erfolgen, wobei der Hauptweg der Embden-Meyerhof-Parnas-Weg ist, aber auch der Entner-Doudoroff-Weg oder der Warburg-Dickens-Hexosemonophosphat-Weg, auch bekannt als des Abbaus von Pentosen.

Der gewählte Weg hängt von dem Enzymsystem ab, das der Mikroorganismus besitzt.

Über Embden-Meyerhof-Parnas

Bei der Fermentation von Glucose über den Embden-Meyerhof-Parnas-Weg wird sie in zwei Triose-Moleküle aufgeteilt, die später bis zur Bildung von Glycerinaldehyd-3-phosphat zu verschiedenen Kohlenstoffverbindungen abgebaut werden. Von dort stammt eine Zwischensubstanz, nämlich Brenztraubensäure.

Von dort werden verschiedene Arten von gemischten Säuren gebildet, die von einer Art zur anderen variieren können.

Dieses System tritt in Abwesenheit von Sauerstoff auf und erfordert eine organische Verbindung als endgültigen Elektronenakzeptor.

Entner-Doudoroff-Weg

Bei der Fermentation von Glucose über den Entner-Doudoroff-Weg wird Glucose-6-phosphat zu Glucono-ᵼ-lacton-6-phosphat und von dort zu 6-Phosphogluconat und 2-Keto-3-desoxy-6- oxidiert Phosphogluconat, um schließlich Brenztraubensäure zu bilden. Dieser Weg benötigt Sauerstoff, damit Glykolyse stattfinden kann.

Pentoses-Abbauweg oder Warburg-Dickens-Hexoxa-Monophosphat-Weg

Diese Route ist eine Mischung aus den beiden oben genannten. Es beginnt ähnlich wie der Entner-Doudoroff-Weg, aber später wird Glycerinaldehyd-3-phosphat als Vorstufe für Brenztraubensäure gebildet, wie es im Embden-Meyerhof-Parnas-Weg vorkommt.

Vorbereitung

Wiegen:

2 g Pepton

5 g Natriumchlorid

10 g D-Glucose (oder das herzustellende Kohlenhydrat)

0,03 g Bromthymolblau

3 g Agar

0,30 g Dikaliumphosphat

1 Liter destilliertes Wasser.

Alle Verbindungen außer dem Kohlenhydrat mischen und in 1 Liter destilliertem Wasser lösen. Erhitzen und schütteln, bis sich alles vollständig aufgelöst hat.

Beim Abkühlen auf 50 ° C werden 100 ml 10% ige Glucose (filtriert) zugegeben.

Verteilen Sie aseptisch 5 ml OF-Medium in Reagenzgläsern mit Baumwollverschluss und autoklavieren Sie bei 121 ° C und 15 Pfund Druck 15 Minuten lang.

In vertikaler Position erstarren lassen.

Der pH-Wert des Mediums sollte 7,1 betragen. Die Farbe des hergestellten Mediums ist grün.

Im Kühlschrank lagern.

Anwendungen

Das OF-Medium ist ein spezielles Medium zur Bestimmung des Stoffwechselverhaltens eines Mikroorganismus gegen ein Kohlenhydrat. Besonders für diejenigen, die wenig, schwache oder keine Säuren bilden.

Gesät

Für jeden Mikroorganismus werden 2 OF-Röhrchen benötigt, beide müssen mit dem zu untersuchenden Mikroorganismus beimpft werden. Die Kolonie wird mit einem geraden Griff aufgenommen und in der Mitte des Röhrchens wird eine Punktion vorgenommen, ohne den Boden zu erreichen. Es können mehrere Einstiche vorgenommen werden, solange kein Interesse an der Beobachtung der Motilität besteht.

Eine Schicht aus sterilem flüssigem Petrolatum oder sterilem geschmolzenem Paraffin (ungefähr 1 bis 2 ml) wird in eines der Röhrchen gegeben und mit dem Buchstaben "F" gekennzeichnet. Die andere Röhre ist original und mit "O" gekennzeichnet. Beide Röhrchen werden bei 35 ° C inkubiert und täglich bis zu 3 bis 4 Tage lang beobachtet.

Deutung

Stoffwechsel und Gasproduktion

Tabelle: Klassifizierung von Mikroorganismen nach ihrem Verhalten in offenen (oxidativen) und geschlossenen (fermentativen) OF-Röhrchen

Quelle: Hergestellt vom Autor MSc. Marielsa Gil

Das Gas wird unter Bildung von Blasen oder Verdrängung des Agars beobachtet.

Es sollte beachtet werden, dass ein Organismus, der Glukose nur oxidiert, aber nicht fermentiert, andere Kohlenhydrate nicht fermentieren kann, auf jeden Fall nur oxidiert. Daher wird in dieser Situation das verschlossene Röhrchen für die Untersuchung anderer Kohlenhydrate weggelassen.

Motilität

Zusätzlich kann Motilität im OF-Medium gesehen werden.

Positive Motilität : Wachstum, das nicht auf den Impfbereich beschränkt ist. Es gibt Wachstum zu den Seiten der Röhre.

Negative Motilität : Wachstum nur im anfänglichen Inokulum.

QA

Die folgenden Stämme können als Qualitätskontrollen verwendet werden: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Moraxella sp. Die erwarteten Ergebnisse sind:

1. coli: Glukosefermenter (sowohl gelbe als auch funkelnde Röhrchen).
2. Aeruginosa: Glukoseoxidationsmittel (offenes gelbes Röhrchen und grüne oder blaue Versiegelung).
3. Moraxella sp: Nicht saccharolytisch (grünes oder blaues offenes Röhrchen, grünes versiegeltes Röhrchen).

Einschränkungen

-Einige Mikroorganismen können nicht im OF-Medium wachsen. In diesen Fällen wird der Test wiederholt, dem Medium werden jedoch 2% Serum oder 0,1% Hefeextrakt zugesetzt.

-Oxidationsreaktionen werden oft nur in der Nähe der Oberfläche beobachtet und der Rest des Mediums kann grün bleiben, genauso wie es als positiv angesehen wird.

Verweise

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