BAKTERIENABSTRICH: EIGENSCHAFTEN UND VORBEREITUNG - BIOLOGIE - 2024

Der Bakterienabstrich ist ein Dünnfilmabstrich einer Suspension von Bakterienmikroorganismen, der auf einer transparenten Glasplatte oder einem Objektträger zur Beobachtung unter einem Lichtmikroskop hergestellt wird.

Die Verlängerung in Form eines Films wird durchgeführt, um die Mikroorganismen so weit wie möglich zu trennen, da die Beobachtung nicht klar ist, wenn sie gruppiert werden.

Abbildung 1. Bakterienabstrich unter einem Rasterelektronenmikroskop. Quelle: pixbay.com

Bei der Untersuchung von Bakterienkulturen werden Abstrichvorbereitungs-, Fixierungs- und Färbetechniken verwendet, um sie besser zu analysieren. Aufgrund der geringen Größe der Mikroorganismen ist für ihre Beobachtung zwangsläufig die Verwendung eines optischen Mikroskops erforderlich.

Optische Mikroskope sind wesentliche Instrumente zur Beobachtung von Abstrichen. Diese verwenden optische Linsen und Licht, um die Proben mit hoher Vergrößerung betrachten zu können.

Im Allgemeinen haben lebende Zellen keine meist farbigen Strukturen, mit dem Lichtmikroskop gesehen sind sie farblose, transparente Proben und sie zeigen sehr wenig inneren Kontrast und zu ihrer Umgebung.

Die Beobachtung mit dem einfachen Lichtfeld-Lichtmikroskop ohne Verwendung von Hilfsfärbetechniken ist sehr begrenzt und wird nur in einigen Fällen verwendet, beispielsweise bei der Beobachtung der Bewegung von Mikroorganismen.

Für eine optimale Beobachtung von Mikroorganismen muss ein Gleichgewicht zwischen Kontrast und Auflösung hergestellt werden. Zelldetails können selbst bei hoher Auflösung nicht unter einem Mikroskop gesehen werden. Die Verwendung von Farbstoffen ist durch Färbetechniken erforderlich, die einen Kontrast für die Beobachtung bieten.

Eigenschaften eines hochwertigen Bakterienabstrichs

Hervorragender Kontrast

Um einen hervorragenden Kontrast zu erzielen, gibt es hochentwickelte Mikroskope, sogenannte Phasenkontrastmikroskope, Differentialinterferenzmikroskope und Dunkelfeldmikroskope. Mit diesem Mikroskoptyp werden unter anderem Bakterienstrukturen wie Hüllen und Filamente beobachtet.

Die Färbung ist eine einfache Technik zur Erhöhung des Kontrasts, die mit einem Hellfeldmikroskop erzielt wird. Bei dieser Technik können verschiedene Färbungen verwendet werden, die die mikroskopische Beobachtung signifikant verbessern.

Die Färbungen werden direkt auf den Abstrichen oder Verlängerungen der Mikroorganismensuspensionen auf den Objektträgern durchgeführt, die zuvor getrocknet und fixiert wurden.

Gute Lösung

Die Fixierung ist eine Technik zur Erhaltung der Zellstrukturen. bewirkt Inaktivierung von Mikroorganismen und Adhäsion am Glas des Objektträgers. Es gibt verschiedene Fixierungsbehandlungen: Wärmefixierung und chemische Fixierung.

Wärmefixierung

Dies ist die am weitesten verbreitete Methode zur Beobachtung von Bakterienabstrichen. Die Technik besteht darin, die Bakteriensuspension des Abstrichs durch die Flamme eines Feuerzeugs zu leiten. Diese Technik ist in der Lage, die äußere Morphologie von Bakterien zu erhalten, zerstört jedoch deren innere Strukturen.

Chemische Fixierung

Bei der chemischen Fixierung werden Konservierungschemikalien wie Formaldehyd oder Formalin, Ethanol und Essigsäure verwendet. Der Vorteil der Verwendung chemischer Fixiermittel besteht darin, dass die Erhaltung der inneren Zellstrukturen der Mikroorganismen erreicht wird.

Abbildung 2. Blutausstrich. Quelle: Bobjgalindo, aus Wikimedia Commons

Gute Färbung

Die gebräuchlichsten Verfahren zum Färben eines zuvor getrockneten und fixierten Abstrichs sind positive oder einfache Färbung, Differenzialfärbung und negative Färbung. Es gibt auch spezielle Techniken zum Färben bestimmter Zellstrukturen (Kapsel, Spore, Flagellen).

Positive Färbung oder einfache Färbung

Positive oder einfache Färbung ist die am weitesten verbreitete Abstrichfärbetechnik. Es werden Farbstoffe verwendet, die an bestimmte mikrobielle Strukturen binden können, so dass sie unter einem Mikroskop beobachtet werden können.

Diese Farbstoffe haben in ihrer chemischen Struktur Chromophorgruppen (farbiger Teil) mit abwechselnden Doppelbindungen und Einfachbindungen (Konjugation). Diese Bindungen können wiederum ionische oder kovalente Bindungen mit einigen Zellstrukturen herstellen.

Die bei der positiven oder einfachen Färbung verwendeten Farbstoffe sind meist chemische Derivate von Anilin (gefärbte organische Salze).

Andererseits finden wir unter den Farbstoffen einige mit einem basischen pH und andere mit einem sauren pH.

Grundfarbstoffe

In basischen Farbstoffen ist die Chromophorgruppe positiv elektrisch geladen. Die überwiegende Mehrheit der prokaryotischen Mikroorganismen hat einen neutralen inneren pH-Wert und ihre Zelloberfläche ist negativ geladen. Durch diese elektrostatische Wechselwirkung bindet sich das Chromophor an die Zelle und färbt sie.

Beispiele für basische Farbstoffe sind unter anderem Methylenblau, Kristallviolett, Malachitgrün, basisches Fuscin, Safranin.

Säurefarbstoffe

In sauren Farbstoffen ist die Chromophorgruppe negativ elektrisch geladen. Diese werden verwendet, um Proteine ​​mit positiv geladenen Aminogruppen zu färben. Beispiele für Säurefarbstoffe sind Säurefuscin, Rosenbengalen, Kongorot und Eosin.

Differenzielle Färbung

Die Differentialfärbungstechnik besteht darin, zwei Farbstoffe unterschiedlicher Farbe oder Intensität aufzutragen, um verschiedene Mikroorganismen unter dem Mikroskop zu unterscheiden. Die Gram-Färbung und die Säure-Alkohol-Resistenzfärbung sind die am häufigsten verwendeten Differenzialfärbungen in der Bakteriologie.

Der Gram-Farbstoff wird als vorläufiger Test verwendet, um die Form, Größe, Zellgruppierung sowie die Art der Zellwand zu kennen. Unter Verwendung des Gram-Färbetests werden Zellwandbakterien in grampositive Bakterien und gramnegative Bakterien klassifiziert.

Negative Färbung

Bei dieser Technik werden chemische Farbstoffe verwendet, die nicht in das Innere der Zelle eindringen, sondern das Medium, in dem sich die Mikroorganismen befinden, als schwarzen Hintergrund erscheinen lassen.

Bei der Negativfärbetechnik wird der Abstrich mit einem Tropfen Tusche oder Nigrosinsuspension gemacht, die nach dem Trocknen bei Raumtemperatur einen undurchsichtigen Film für den Lichtdurchgang bildet. Auf diese Weise erscheinen Mikroorganismen als helle Formen auf einem dunklen Hintergrund.

Vorbereitung

A. Abstrich

1.- Waschen Sie die Objektträger sehr gut, trocknen Sie sie mit saugfähigem Papier und beschriften Sie sie. Auf dem Etikett müssen der Inhalt der Zubereitung, das Datum und der Name der Person angegeben sein, die sie verarbeitet hat.

2.- Zünden Sie das Feuerzeug an und sterilisieren Sie die Impfschleife in der Flamme, bis sie hellrot ist.

3.- Lassen Sie den Griff abkühlen.

4.- Nehmen Sie das Bakterienkulturröhrchen, entfernen Sie die Kappe und führen Sie schnell die Öffnung des Röhrchens in der Nähe der Brennerflamme (Flamme) durch.

5.- Setzen Sie die Inokulationsschleife in das Röhrchen mit der Bakterienkultur ein und entnehmen Sie die Probe.

6.- Wenn sich die Kultur in flüssigem Medium befindet, legen Sie die mit dem Griff entnommene Probe in die Mitte des Objektträgers und verteilen Sie sie vorsichtig in einem Kreis mit einem Durchmesser von ca. 2 cm.

7.- Sterben Sie die Impfschleife erneut.

8.- Lassen Sie den Abstrich an der Luft trocknen.

9.- Wiederholen Sie die Schritte 3 bis 8 dreimal.

10.- Wenn sich die Kultur in festem Medium befindet, muss zuvor ein Tropfen destilliertes Wasser auf den Objektträger gegeben werden. Dies wird durchgeführt, um eine kleine Probe der Kultur zu mischen, die mit der Inokulationsschleife entnommen wurde, wie in den Schritten 2 bis 5 (aseptische Bedingungen) angegeben.

11.- Die verdünnte Probe mit dem Wassertropfen auf dem Objektträger verteilen und dreimal wiederholen.

B. Fixierung

1.- Geben Sie zwei Tropfen Methanol oder absolutes Ethanol zu den trockenen Abstrichen - aus Kulturen in flüssigem Medium -.

2.- Lassen Sie die Luft vom Feuerzeug abtrocknen.

3.- Wenn der Abstrich aus einer Kultur in festem Medium stammt, wird der trockene Abstrich mit Wärme fixiert und zwei- bis dreimal schnell durch den heißesten Teil der leichteren Flamme geleitet.

4.- Berühren Sie den unteren Teil des Abstrichs mit dem dorsalen Teil der linken Hand (für Rechtshänder; andernfalls verwenden Sie die rechte Hand) und stellen Sie sicher, dass es kalt ist.

C. Einfache Färbung

1.- Fügen Sie dem Abstrich 2 Tropfen des ausgewählten Flecks hinzu und lassen Sie ihn für die in den spezifischen Protokollen für jeden Fleck erforderliche Zeit einwirken (im Allgemeinen zwischen 1 und 5 Minuten).

2.- Einige Flecken erfordern die Verwendung von Wärme für ihre Aktivierung. In diesem Fall muss beim Erhitzen des Objektträgers in der leichteren Flamme sehr vorsichtig vorgegangen werden (mit einer Pinzette manipulieren und nicht kochen). Überhitzung des Abstrichs kann die zu beobachtenden Zellen zerstören.

3.- Entfernen Sie überschüssiges Farbstoff durch Waschen mit destilliertem Wasser von einer Picette. Entfernen Sie das Waschwasser, indem Sie vorsichtig auf den Schlitten an der Kante klopfen, der auf dem Arbeitstisch geneigt ist.

4.- Luft trocknen lassen.

5.- Abhängig von der Art der Beobachtung wird zu diesem Zeitpunkt ein Deckglas verwendet oder nicht. Das Deckglas schützt und bewahrt den Abstrich. Wenn zu diesem Zeitpunkt eine Ölimmersionsbeobachtung durchgeführt wird, werden keine Deckgläser verwendet, aber der Abstrich kann nicht erhalten werden.

D. Endgültige Erhaltung des Abstrichs

1.- Tauchen Sie den Abstrich nacheinander mindestens 5 Minuten lang in jede der unten angegebenen Lösungen. Der Zweck dieser "Bäder" besteht darin, den Abstrich vollständig zu dehydrieren. Jedes Reagenz sollte gründlich abgelassen werden, bevor der Abstrich in das nächste Bad eingeführt wird.

Die Reihenfolge der Entwässerungsbäder ist wie folgt:

1. Ethanol 70%
2. Ethanol 95%
3. Reines Aceton
4. Aceton-Xylol 1: 1-Mischung
5. Xylol

Dann an der Luft trocknen lassen.

2.- Befestigen Sie das Deckglas, vorzugsweise 22 × 22 mm, mit Kanada-Balsam oder einem anderen Befestigungsmedium.

Verweise

1. Briggs, G. (1965). Ursachen für mikrobiologische Laborunfälle und Infektionen. Biologische Laboratorien der US-Armee. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG und Welch, CT (2017). Mikrobiologie: Ein Laborhandbuch. Pearson.
3. Holt, JG Herausgeber. (1977). Das kürzere Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 8 ^th Baltimore: The Williams und Wilkins Co.
4. Johnson, TR und Case; CL (2018). Laborexperimente in der Mikrobiologie. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostische Mikrobiologie. 14 ^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.