ZIEHL-NEELSEN-FÄRBUNG: BEGRÜNDUNG, REAGENZIEN UND TECHNIK - BIOLOGIE - 2025

Das Ziehl-Neelsen ist eine Färbetechnik zur Identifizierung von gegen Mikroorganismen resistenter Alkoholsäure (ARA). Der Name dieses mikrobiologischen Verfahrens bezieht sich auf seine Autoren: den Bakteriologen Franz Ziehl und den Pathologen Friedrich Neelsen.

Diese Technik ist eine Art Differenzialfärbung, bei der verschiedene Farbstoffe verwendet werden, um einen Kontrast zwischen den Strukturen zu erzeugen, die Sie beobachten, differenzieren und später identifizieren möchten. Die Ziehl-Neelsen-Färbung wird verwendet, um bestimmte Arten von Mikroorganismen zu identifizieren.

Ziehl-Neelsen-Fleck

Einige dieser Organismen sind Mykobakterien (z. B. Mycobacterium tuberculosis), Nocardia (z. B. Nocardia sp.) Und einige einzellige Parasiten (z. B. Cryptosporidium parvum). Viele der Bakterien können durch eine übliche Technik klassifiziert werden, die als Gram-Färbung bezeichnet wird.

Einige Bakteriengruppen erfordern jedoch andere Methoden, um sie identifizieren zu können. Techniken wie die Ziehl-Neelsen-Färbung erfordern Kombinationen von Farbstoffen mit Wärme, um die ersteren an der Zellwand zu befestigen.

Dann folgt ein Bleichprozess, der zwei Ergebnisse ermöglicht: Beständigkeit oder Empfindlichkeit gegenüber Verfärbungen durch Säuren und Alkohole.

Basis

Die Begründung für diese Färbetechnik basiert auf den Eigenschaften der Zellwand dieser Mikroorganismen. Die Wand besteht aus einer Art von Fettsäuren, die als Mykolsäuren bezeichnet werden. Diese zeichnen sich durch sehr lange Ketten aus.

Wenn Fettsäuren sehr lange Strukturen haben, können sie Farbstoffe leichter zurückhalten. Einige Bakteriengattungen sind aufgrund des hohen Gehalts an Mykolsäuren in der Zellwand durch Gram-Färbung sehr schwer zu färben.

Die Ziehl-Neelsen-Färbung verwendet die Phenolverbindung Carbol Fuchsin, eine Grundfärbung. Dies hat die Fähigkeit, mit den Fettsäuren der Zellwand zu interagieren, die bei Raumtemperatur eine wachsartige Textur aufweist.

Die Carbol-Fuchsin-Färbung wird in Gegenwart von Wärme verstärkt, da das Wachs schmilzt und die Farbstoffmoleküle schneller in die Zellwand gelangen.

Die später verwendete Säure dient dazu, Zellen zu verfärben, die nicht gefärbt wurden, weil ihre Wand nicht ausreichend mit dem Farbstoff verwandt war; Daher kann die Stärke des Säurebleichmittels den Säurefarbstoff entfernen. Zellen, die dieser Verfärbung widerstehen, werden als säurefest bezeichnet.

Sekundärfarbstoff

Nach dem Entfärben der Probe wird sie einem anderen Farbstoff gegenübergestellt, der als Sekundärfarbstoff bezeichnet wird. Im Allgemeinen wird Methylenblau oder Malachitgrün verwendet.

Der Sekundärfarbstoff färbt das Hintergrundmaterial und erzeugt folglich einen Kontrast zu den Strukturen, die im ersten Schritt gefärbt wurden. Nur verfärbte Zellen absorbieren den zweiten Farbstoff (Gegenfärbung) und nehmen ihre Farbe an, während säurefeste Zellen ihre rote Farbe behalten.

Dieses Verfahren wird häufig zur Identifizierung von Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium leprae verwendet, die als säurefeste Bazillen bezeichnet werden.

Reagenzien

Primärfarbstoff

Es wird 0,3% Carbolfuchsin (gefiltert) verwendet. Dieser Farbstoff wird aus einer Mischung von Alkoholen hergestellt: Phenol in Ethanol (90%) oder Methanol (95%), und in dieser Mischung werden 3 g basisches Fuchsin gelöst.

Bleichlösung

In diesem Schritt können Lösungen von 3% Alkoholsäure oder 25% Schwefelsäure verwendet werden.

Sekundärfarbstoff (Gegenfarbstoff)

Der zum Kontrastieren der Proben am häufigsten verwendete Farbstoff ist üblicherweise 0,3% Methylenblau. Es können jedoch auch andere verwendet werden, beispielsweise 0,5% Malachitgrün.

Technik

Säurefeste Färbeprozedur

Bereiten Sie einen Bakterienabstrich vor

Diese Vorbereitung erfolgt auf einem sauberen, trockenen Objektträger unter Beachtung der Vorsichtsmaßnahmen zur Sterilität.

Abstrich trocknen

Lassen Sie den Abstrich bei Raumtemperatur trocknen.

Probe erhitzen

Die Probe sollte durch Anlegen eines Feuers auf den darunter liegenden Objektträger erhitzt werden. Eine Alkoholfixierung kann durchgeführt werden, wenn der Abstrich nicht mit Sputum (behandelt mit Natriumhypochlorit, um ihn aufzuhellen) hergestellt wurde und wenn er nicht sofort färbt.

M. tuberculosis wird mit Bleichmittel und während des Färbevorgangs entfernt. Die Wärmefixierung von unbehandeltem Sputum tötet M. tuberculosis nicht ab, während die Alkoholfixierung bakterizid ist.

Decken Sie den Fleck ab

Der Fleck wird mit der Carbol-Fuchsin-Lösung (primärer Grundfleck) bedeckt.

Den Fleck erhitzen

Dies erfolgt für 5 Minuten. Sie sollten eine Dampfentwicklung feststellen (ca. 60 ° C). Es ist wichtig, die Probe nicht zu überhitzen und ein Verbrennen zu vermeiden.

Beim Erhitzen des Flecks ist beim Erhitzen des Carbolfuchsins besondere Vorsicht geboten, insbesondere wenn die Färbung auf einem Tablett oder einem anderen Behälter durchgeführt wird, in dem leicht entflammbare Chemikalien aus der vorherigen Färbung gesammelt wurden.

Mit einem zuvor angezündeten Tupfer, der mit einigen Tropfen saurem Alkohol, Methanol oder 70% igem Ethanol angefeuchtet ist, sollte nur eine kleine Flamme unter den Objektträgern angebracht werden. Verwenden Sie keinen großen, mit Ethanol getränkten Tupfer, da dies eine Brandgefahr darstellt.

Waschen Sie den Fleck

Diese Wäsche muss mit sauberem Wasser durchgeführt werden. Wenn das Leitungswasser nicht sauber ist, waschen Sie den Abstrich vorzugsweise mit gefiltertem oder destilliertem Wasser.

Decken Sie den Abstrich mit saurem Alkohol ab

Dieser saure Alkohol sollte 3% betragen. Die Bedeckung wird 5 Minuten lang durchgeführt oder bis der Abstrich ausreichend verfärbt ist, d. H. Eine blassrosa Farbe hat.

Es muss berücksichtigt werden, dass saurer Alkohol brennbar ist; Daher muss es mit großer Sorgfalt verwendet werden. Vermeiden Sie es, sich in der Nähe von Zündquellen zu befinden.

Waschen Sie den Fleck

Das Waschen sollte mit sauberem, destilliertem Wasser erfolgen.

Decken Sie den Abstrich mit Flecken ab

Es kann 1 bis 2 Minuten lang Malachitgrün (0,5%) oder Methylenblau (0,3%) sein, wobei die längere Zeit verwendet wird, wenn der Abstrich dünn ist.

Waschen Sie den Fleck

Wieder sollte sauberes (destilliertes) Wasser verwendet werden.

Abfließen

Die Rückseite des Objektträgers sollte gereinigt und der Fleck auf ein Drainagegestell gelegt werden, damit er an der Luft trocknen kann (zum Trocknen kein saugfähiges Papier verwenden).

Untersuchen Sie den Abstrich unter dem Mikroskop

Das 100X-Objektiv und das Immersionsöl müssen verwendet werden. Scannen Sie den Abstrich systematisch und zeichnen Sie die relevanten Beobachtungen auf.

Interpretieren Sie die Ergebnisse

Theoretisch werden Mikroorganismen, die eine rötliche Farbe färben, als säurefest positiv (AAR +) angesehen.

Wenn umgekehrt die Mikroorganismen je nach dem als Gegenfarbstoff verwendeten Farbstoff blau oder grün färben, gelten sie als säurefest negativ (AAR-).

Verweise

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