SPORENFÄRBUNG: GRÜNDE, TECHNIKEN UND VERWENDUNGEN - BIOLOGIE - 2025

Die Sporenfärbung ist die Methode, mit der die Resistenzstrukturen gefärbt werden, die unter ungünstigen Bedingungen einige Bakteriengattungen bilden. Diese Strukturen entsprechen einer Form des Überlebens.

Es gibt viele Gattungen, die Sporen bilden; Die wichtigsten sind jedoch Bacillus und Clostridium. Diese Gattungen gelten als relevanter, da sie für den Menschen pathogene Arten aufweisen.

Sporenfärbung nach der Shaeffer-Fulton- oder Wirtz-Conklin-Methode. Und Tambe (Original-Uploader) von Wikimedia Commons

Jeder Bazillus kann zu einer Spore führen. Zum Zeitpunkt der Färbung des Präparats befindet sich die Spore innerhalb oder außerhalb des Bazillus (Endospore) oder außerhalb des Bazillus (Exospore). Bei herkömmlichen Färbetechniken für Bakterien - wie der Gram-Färbung - bleiben die Sporen farblos.

Gegenwärtig gibt es mehrere Färbemethoden, die in der Lage sind, die dicke Struktur der Spore zu durchdringen, um sie zu färben. Diese Methoden sind sehr unterschiedlich; Dazu gehören die Dorner-Technik, die Möeller-Färbung und die Shaeffer-Fulton-Methode, auch bekannt als Wirtz-Conklin.

Von allen genannten Techniken wird die Shaeffer-Fulton-Methode in Routinelabors am häufigsten verwendet. Es ist nach zwei Mikrobiologen benannt, die 1930 die Färbung kreierten: Alicia Shaeffer und MacDonald Fulton. Die Technik wird jedoch manchmal nach zwei Bakteriologen aus den 1900er Jahren Wirtz-Conklin genannt.

Basis

Die Sporen färben sich nicht mit herkömmlichen Flecken, da sie eine sehr dicke Wand haben. Die komplexe Zusammensetzung der Sporen verhindert den Eintritt der meisten Farbstoffe.

Wenn die Spore von außen nach innen untersucht wird, werden die folgenden Schichten beobachtet: Erstens gibt es das Exosporium, die dünnste und äußere Schicht, die von Glykoproteinen gebildet wird.

Als nächstes kommt die Nagelhaut, die gegen hohe Temperaturen resistent ist, gefolgt von der aus Peptidoglycan bestehenden Kortikalis. Später befindet sich die Wand der Basis, die den Protoplasten schützt.

Die Spore ist eine dehydrierte Struktur, die 15% Calcium und Dipicolinsäure enthält. Daher beruhen die meisten Sporenfärbetechniken auf der Anwendung von Wärme, so dass der Farbstoff die dicke Struktur durchdringen kann.

Sobald die Spore gefärbt ist, kann sie den Farbstoff nicht mehr entfernen. Bei der Shaeffer-Fulton-Technik dringt Malachitgrün in vegetative Zellen ein und dringt bei Hitzeeinwirkung sowohl in die Endospore als auch in die Exosporen ein.

Durch Waschen mit Wasser wird der Farbstoff aus der vegetativen Zelle entfernt. Dies liegt daran, dass der Malachitgrün-Farbstoff leicht basisch ist und sich daher schwach an die vegetative Zelle bindet.

Stattdessen kann es nicht aus der Spore austreten und schließlich wird der Bazillus mit Safranin gegengefärbt. Diese Grundlage gilt für den Rest der Techniken, bei denen etwas Ähnliches passiert.

Sporenfärbetechniken

Zur Durchführung der Sporenfärbung muss eine Reinkultur des zu untersuchenden verdächtigen Stammes erhalten werden.

Die Kultur wird 24 Stunden lang extremen Temperaturen ausgesetzt, um den Mikroorganismus zur Sporulation anzuregen. Hierzu kann die Kultur 24 oder 48 Stunden in einen Ofen bei 44 ° C oder in einen Kühlschrank (8 ° C) gestellt werden.

Wenn bei den genannten Temperaturen zu lange belassen wird, werden nur Exosporen beobachtet, da alle Endosporen den Bazillus bereits verlassen haben.

Am Ende der Zeit sollten einige Tropfen sterile physiologische Lösung auf einen sauberen Objektträger gegeben werden. Dann wird ein kleiner Teil der Kultur entnommen und ein feiner Aufstrich gemacht.

Danach wird es trocknen gelassen, in der Hitze fixiert und mit einer der unten erläuterten Techniken gefärbt:

Dorner-Technik

1- Bereiten Sie in einem Reagenzglas eine konzentrierte Suspension des sporulierten Mikroorganismus in destilliertem Wasser vor und geben Sie ein gleiches Volumen gefiltertes Kinyoun-Carbolfuchsin hinzu.

2- Stellen Sie das Röhrchen zwischen 5 und 10 Minuten in ein Bad mit kochendem Wasser.

3- Mischen Sie auf einem sauberen Objektträger einen Tropfen der vorherigen Suspension mit einem Tropfen 10% iger wässriger Nigrosinlösung, gekocht und filtriert.

4- Bei milder Hitze schnell verteilen und trocknen.

5- Mit einem 100X-Objektiv untersuchen (Eintauchen).

Die Sporen färben sich rot und die Bakterienzellen erscheinen vor einem dunkelgrauen Hintergrund fast farblos.

Modifizierte Dorner-Technik

1- Eine Suspension des sporulierten Mikroorganismus wird auf einem Objektträger verteilt und in der Hitze fixiert.

2- Die Probe wird mit einem Filterpapierstreifen bedeckt, dem Carbolfuchsin zugesetzt wird. Das Färbemittel wird 5 bis 7 Minuten mit der Flamme des Bunsenbrenners erhitzt, bis die Entwicklung von Dämpfen erzeugt wird. Dann wird das Papier entfernt.

3- Das Präparat wird mit Wasser gewaschen und dann mit saugfähigem Papier getrocknet.

4- Decken Sie den Abstrich mit einem dünnen Film aus 10% Nigrosin ab und verteilen Sie das Nigrosin oder eine Nadel mit einem zweiten Objektträger.

Die Färbung der Sporen und Bakterien ist die gleiche wie die im Stand der Technik beschriebene.

Shaeffer - Fulton- oder Wirtz-Conklin-Technik

1- Machen Sie einen feinen Abstrich mit einer Suspension des sporulierten Mikroorganismus auf einem Objektträger und fixieren Sie ihn auf Hitze.

2- Decken Sie den Objektträger mit 5% iger wässriger Malachitgrünlösung ab (Sie können ein Filterpapier auf den Objektträger legen).

3- Erhitzen Sie die Flamme des Bunsenbrenners, um Dämpfe freizusetzen, und entfernen Sie die Flamme. Wiederholen Sie den Vorgang für 6 bis 10 Minuten. Wenn die Malachitgrün-Lösung während des Verfahrens zu stark verdunstet, kann mehr hinzugefügt werden.

4- Entfernen Sie das Filterpapier (falls installiert) und waschen Sie es mit Wasser.

5- Decken Sie den Objektträger 30 Sekunden lang mit 0,5% igem wässrigem Safranin ab (einige Varianten der Technik verwenden 0,1% iges wässriges Safranin und lassen Sie ihn 3 Minuten lang stehen).

Bei dieser Technik erscheinen die Sporen grün und die Bazillen rot.

Es hat den Nachteil, dass sich die Endosporen junger Kulturen nicht gut färben, da sie extrem klar oder farblos erscheinen. Um dies zu vermeiden, wird empfohlen, Kulturen mit einer Inkubationszeit von 48 Stunden zu verwenden.

Möeller-Technik

1- Decken Sie den Abstrich 2 Minuten lang mit Chloroform ab.

2- Entsorgen Sie das Chloroform.

3- 5 Minuten mit 5% iger Chromsäure abdecken.

4- Mit destilliertem Wasser waschen

5- Das Blatt ist mit Carbolfuchsin-Fenicada bedeckt und bis zur Emission von Dämpfen der Flamme des Bunsenbrenners ausgesetzt. dann wird es für einige Momente aus der Flamme entfernt. Der Vorgang wird wiederholt, bis 10 Minuten abgeschlossen sind.

6- Mit Wasser waschen.

7- Verwenden Sie angesäuertes Ethanol (Salzalkohol) zum Verfärben. Es bleibt für 20 oder 30 Sekunden.

8- Mit destilliertem Wasser waschen.

9- Kontrastieren Sie, indem Sie das Blatt 5 Minuten lang mit Methylenblau bedecken.

10- Mit destilliertem Wasser waschen.

11- Lassen Sie es trocknen und die Probe wird zum Mikroskop genommen.

Die Sporen erscheinen rot und die Bazillen blau. Es ist wichtig, die Dämpfe nicht einzuatmen, da sie giftig sind und langfristig krebserregend sein können.

Modifizierte Möeller-Technik ohne Hitze

2007 entwickelten Hayama und seine Mitarbeiter eine Modifikation der Möeller-Technik. Sie eliminierten den Schritt des Erhitzens des Farbstoffs und ersetzten ihn durch Zugabe von 2 Tropfen des Tensids Tergitol 7 pro 10 ml Carbolfuchsin-Carbol-Lösung. Die gleichen Ergebnisse wurden erhalten.

Anwendungen

Die Färbung von Sporen liefert sehr wertvolle und nützliche Informationen zur Identifizierung des Erregers, da sein Vorhandensein, seine Form, seine Position innerhalb des Bazillus und die Fähigkeit, die vegetative Zelle zu deformieren oder nicht, Daten sind, die die Art leiten können innerhalb eines bestimmten Genres beteiligt.

In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass die Sporen rund oder oval sein können, sich in der Mitte oder auch in einer parazentralen, subminalen oder terminalen Position befinden können.

Diagramm der Form und Position von Endosporen und Exosporen

Beispiele

- Clostridium difficile bildet in einer Endposition eine ovale Spore, die den Bazillus deformiert.

- Die Spore von Clostridium tertium ist oval, verformt den Bazillus nicht und befindet sich auf terminaler Ebene.

- Die Endospore von Clostridium tetani ist endständig und verformt den Bazillus, wodurch das Aussehen eines Trommelstocks entsteht.

- Die Sporen von Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy und C. septicum sind rund oder oval subterminal und verformen den Bazillus.

- Die Endospore von Clostridium sordelli befindet sich in zentraler Position mit einer leichten Verformung.

Koneman E., Allen S., Janda W., Schreckenberger P., Winn W. (2004). Mikrobiologische Diagnose. (5. Aufl.). Argentinien, Editorial Panamericana SA

Verweise

1. Hayama M., Oana K., Kozakai T., Umeda S., Fujimoto J., Ota H., Kawakami Y. Vorschlag einer vereinfachten Technik zum Färben von Bakteriensporen ohne Anwendung von Wärme - erfolgreiche Modifikation der Moeller-Methode. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Wikipedia-Mitwirkende. Moeller Fleck. Wikipedia, die freie Enzyklopädie. 3. November 2018, 03:28 UTC. Verfügbar unter: en.wikipedia.org
3. Pérez R., Juárez M., Rodríguez (2011). Laborhandbuch für mikrobiologische Techniken. Institut für Grundlagenwissenschaften Akademie für Mikrobiologie. Nationales Polytechnisches Institut.
4. "Endospore." Wikipedia, die freie Enzyklopädie. 25. Februar 2018, 10:20 UTC. 10. Januar 2019, 02:42 Uhr: en.wikipedia.org
5. Silva L., Silva C., Fernández N., Bueno C., Torres J., Rico M., Macías J. und Mitarbeiter. (2006). Arbeitspersonal der Autonomen Gemeinschaft Extremadura. Spezifische Tagesordnung Band IV. Editorial MAD. Sevilla-Spanien, S. 211-212.
6. Silva M., García M., Corrales J., Ponce E. (2006). Fachlabortechniker, Galizischer Gesundheitsdienst (SERGAS). Spezifisches Thema Agenda Band 2. Editorial MAD. Sevilla-Spanien, S. 79-80.
7. Koneman E., Allen S., Janda W., Schreckenberger P., Winn W. (2004). Mikrobiologische Diagnose. (5. Aufl.). Argentinien, Editorial Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weißfeld A. 2009. Mikrobiologische Diagnose von Bailey & Scott. 12 ed. Argentinien. Editorial Panamericana SA