VOGES-PROSKAUER-TEST: GRUNDLAGE, VORBEREITUNG UND VERWENDUNG - BIOLOGIE - 2024

Der Voges-Proskauer- Test ist ein biochemischer Test, der zur Identifizierung von Bakterien der Familie der Enterobacteriaceae verwendet wird. Es ist besonders nützlich, um unter anderem Escherichia coli-Stämme von Klebsiella und Enterobacter zu unterscheiden.

Der Test wird in einem flüssigen Kulturmedium namens Methyl Red - Voges Proskauer durchgeführt, besser bekannt unter dem Akronym RM / VP. Dieses Medium besteht aus gepuffertem Polypepton, Glucose, Dikaliumphosphat und destilliertem Wasser.

Handelsmedium Methyl-Voges Proskauer (RM / VP) kommerzielles Medium / VP-Test positiv bzw. negativ. Quelle: Foto des Autors MSc. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, aus Wikimedia Commons

Das derzeitige RM / VP-Medium ist eine Modifikation des Clark- und Lubs-Mediums, das ursprünglich eine geringere Konzentration an Peptonen und Glucose enthielt. Somit wurde weniger Wasserstoffion erzeugt, das für die positive Voges-Proskauer-Reaktion benötigt wird.

Der Test basiert auf der Fähigkeit des Mikroorganismus, Glucose über den Butylen-Glykol-Weg zu verwenden und in Gegenwart von Sauerstoff und einem alkalischen pH-Wert ein neutrales Endprodukt namens Acetoin zu bilden.

Im RM / VP-Medium kann neben dem Voges-Proskauer-Test auch der Methylrot-Test nachgewiesen werden.

Basis

Voges-Proskauer Testbasis

Die im Medium vorhandenen Pluripeptone liefern die wesentlichen Nährstoffanforderungen für das Bakterienwachstum. Glukose ist ihrerseits die Hauptverbindung. Viele Bakterien haben die Fähigkeit, Glukose zu metabolisieren und Brenztraubensäure zu bilden.

Brenztraubensäure ist ein Mittelpunkt des Glukosestoffwechsels und von dort aus kann jeder Mikroorganismus unterschiedliche Wege gehen. Einige bilden gemischte Säuren wie Milchsäure, Essigsäure, Ameisensäure und Bernsteinsäure, andere bilden neutrale Produkte wie 2,3-Butandiol.

Der Voges-Proskauer-Test zeigt die Fähigkeit des Mikroorganismus, unter aeroben Bedingungen Acetylmethylcarbinol (Acetoin), ein Zwischenprodukt von 2,3-Butandiol, zu bilden.

Acetoin wird reduziert und bildet 2,3-Butandiol, aber diese Reaktion ist reversibel. Wenn also 2,3-Butandiol oxidiert wird, wird Acetoin gebildet. Daher ist Sauerstoff essentiell.

Dikaliumphosphat ist der Puffer, der die Mischung bei pH 6,9 ± 0,2 puffert.

Grundlage für die Offenlegung und Interpretation von Beweismitteln

Um die Reaktion zu demonstrieren, muss eine Entwicklung unter Verwendung von zwei Reagenzien (Barrit-Reagenzien) durchgeführt werden, die als Voges A und Voges B bekannt sind.

Voges A ist eine 5% ige Lösung von α-Naphthol und Voges B ist eine 40% ige Kaliumhydroxidzubereitung. Wenn Kaliumhydroxid nicht verfügbar ist, kann es durch 40% iges Natriumhydroxid ersetzt werden.

Α-Naphthol ist ein Katalysator, der die Intensität der Reaktionsfarbe erhöht und den Test empfindlicher macht. Das α-Naphthol muss immer zuerst zugegeben werden, wobei das Röhrchen geschüttelt wird, damit das Medium mit dem Sauerstoff in Kontakt kommt. Auf diese Weise wird das vorhandene Acetoin zu Diacetyl oxidiert und 2,3-Butandiol wird zu Acetoin oxidiert, wobei dieses zu Diacetyl geleitet wird.

Auf diese Weise bindet α-Naphthol an Diacetyl, das sich wiederum mit dem in der Aminosäure Arginin vorhandenen Guanidinkern verbunden hat, wobei letzterer von Pluripeptonen stammt.

Kalium- oder Natriumhydroxid ist seinerseits für die Absorption von CO ₂ und die Reaktion mit Peptonen verantwortlich. Diese Reaktion führt zur Bildung einer lachsrosa Farbe, die nach sehr gutem Schütteln des Röhrchens deutlich sichtbar ist.

Die richtigen Mengen an Diacetyl, Pepton und α-Naphthol müssen gemischt werden, damit die Farbe sofort auftritt. Geschieht dies nicht, darf das Röhrchen vor dem Dolmetschen 15 Minuten ruhen.

Der Test ist normalerweise nach 2 bis 5 Minuten positiv, wenn eine schwache rosa Farbe erkennbar ist. Wenn Sie 30 Minuten bis 1 Stunde stehen lassen, ist die Intensität der Farbe maximal (intensives Rot).

Ein negativer Test wird angezeigt, wenn die Brühe gelb wird. Wenn der Test nach 1 Stunde negativ ist, kann sich durch die Reaktion von Kaliumhydroxid auf α-Naphthol eine Kupferfarbe bilden.

Vorbereitung

Mittleres MR / VP

17 g des dehydrierten Kulturmediums werden gewogen und in einem Liter destilliertem Wasser gelöst. 5 Minuten stehen lassen. Zum Kochen bringen, um sich vollständig aufzulösen. 3 bis 4 ml in Röhrchen servieren und im Autoklaven 15 Minuten bei 121 ° C sterilisieren.

Das dehydrierte Kulturmedium hat eine beige Farbe und das hergestellte Medium eine hell bernsteinfarbene Farbe.

Der endgültige pH-Wert des Mediums beträgt 6,9 ± 0,2.

Voges Ein Reagenz

5 g α-Naphthol werden abgewogen und in 50 ml Ethylalkohol (absolut) gelöst. Fügen Sie dann Ethylalkohol hinzu, bis 100 ml erreicht sind.

Voges B Reagenz

40 g Kaliumhydroxid werden abgewogen und in 50 ml destilliertem Wasser in einem Becherglas gelöst. Das Glas muss zur Kontrolle der Temperatur in ein kaltes Wasserbad gestellt werden, da die Temperatur beim Auflösen der Zubereitung stark ansteigt.

Nachdem die Lösung kalt ist, wird sie in einen Messkolben überführt und mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

Voges-Proskauer-Testverfahren

Zur Durchführung des Voges-Proskauer-Tests wird eine RM / VP-Brühe mit dem untersuchten Mikroorganismus aus einer Reinkultur 18 bis 24 Stunden lang inokuliert.

Das Inokulum sollte nicht sehr dicht sein. Es wird 24 bis 48 Stunden bei 35-37 ° C inkubiert, obwohl manchmal eine Inkubation über mehrere Tage erforderlich ist. Cowan und Steel sind der Meinung, dass 5 Tage die minimale Inkubationszeit sind, die erforderlich ist, um alle positiven Voges-Proskauer (VP) -Spezies der Familie der Enterobacteriaceae nachzuweisen.

Testentwicklung

Trennen Sie ein 1-ml-Aliquot in ein Röhrchen und entwickeln Sie es wie folgt: Geben Sie 12 Tropfen (0,6 ml) Voges A-Reagenz und 4 Tropfen (0,2 ml) Voges B. Zum Belüften mischen und absetzen lassen für 5 - 10 Minuten vor dem Dolmetschen. Wenn der Test jedoch immer noch negativ ist, lassen Sie ihn sitzen und beobachten Sie das Röhrchen nach 30 Minuten bis 1 Stunde.

Das Auftreten einer rosaroten Farbe zeigt an, dass die Voges-Proskauer-Reaktion positiv ist. Bleibt das Medium gelb, ist die Reaktion negativ.

Das Hinzufügen von Entwicklern in der angegebenen Reihenfolge und Menge ist wichtig, um falsche Negative zu vermeiden.

Verwenden

Der Voges-Proskauer-Test ist nützlich, um zwischen VP-negativen E. coli-Stämmen der Gattungen Klebsiella, Enterobacter, Serratia und anderen VP-positiven Stämmen zu unterscheiden.

Quelle: Koneman E., Allen S., Janda W., Schreckenberger P., Winn W. (2004). Mikrobiologische Diagnose. 5. Aufl. Editorial Panamericana SA Argentinien.

QA

Kontrollstämme können verwendet werden, um die Qualität des hergestellten Mediums zu testen, einschließlich Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium und Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Die erwarteten Ergebnisse sind positive Voges-Proskauer-Reaktionen nur für K. pneumoniae und E. cloacae. Der Rest gibt negative Reaktionen.

Verweise

1. Britannia Laboratories. MR-VP Medium. 2015. Verfügbar unter: www.britanialab.com
2. Microkit Laboratories. M-Ident Voges Proskauer. 2014. Verfügbar: http://www.medioscultivo.com
3. Mac Faddin J. (2003). Biochemische Tests zur Identifizierung von Bakterien von klinischer Bedeutung. 3rd ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentinien.
4. Forbes B., Sahm D., Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Mikrobiologische Diagnose. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentinien.
5. Koneman E., Allen S., Janda W., Schreckenberger P., Winn W. (2004). Mikrobiologische Diagnose. 5. Aufl. Editorial Panamericana SA Argentinien.