DNA-SEQUENZIERUNG: MAXAM-GILBERT, METHODE UND BEISPIELE - BIOLOGIE - 2025

Die DNA-Sequenzierung (Desoxyribonukleinsäure) ist ein Verfahren in molekularbiologischen Labors, mit dem die Reihenfolge der Nukleotide im interessierenden genetischen Material ermittelt werden kann. Weiterhin kann auch die Sequenzierung von RNA (Ribonukleinsäure) offenbart werden.

Diese Technik war für die Entwicklung der Biowissenschaften unverzichtbar. Es gilt auch für andere Wissensbereiche - wie zum Beispiel die medizinische Diagnose und forensische Untersuchungen.

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Zuvor wurde die Sequenzierung eines DNA-Strangs als langsame und teure Aktivität angesehen, die die Identifizierung nur weniger Basenpaare in den Oligonukleotiden ermöglichte.

Trotz aller Fortschritte in der Wissenschaft ist die DNA-Sequenzierung in vielen Labors weltweit eine Routineoperation, dank des Beitrags von fast 50 Jahren Forschung auf diesem Gebiet. In Bezug auf die Kettenlänge können bis zu Millionen von Basenpaaren in sehr kurzer Zeit sequenziert werden.

Zu diesem Zweck wurden Dutzende von Techniken entwickelt, die sich in Preis und Präzision unterscheiden. In diesem Artikel werden sowohl klassische als auch moderne Techniken mit ihren Vor- und Nachteilen beschrieben.

Bisher ermöglichen Sequenzierungstechniken die Gewinnung der Sequenz vollständiger Genome von kleinen Prokaryoten und Hefen bis zum menschlichen Genom.

DNA-Struktur

Um die für die DNA-Sequenzierung verwendeten Methoden und Techniken zu verstehen, müssen bestimmte Schlüsselaspekte der Struktur und Zusammensetzung des Moleküls bekannt sein.

DNA ist ein Biomolekül, das in allen Lebewesen vorkommt, von Bakterien bis zu großen Wassertieren. Organellen - wie Mitochondrien und Chloroplasten - enthalten ein zirkuläres DNA-Molekül. Selbst bei einigen Viren ist das gefundene genetische Material DNA.

Strukturell ist DNA eine Sammlung von Nukleotiden. Jedes besteht aus einem Kohlenhydrat, einer stickstoffhaltigen Base (A, T, C oder G) und einer Phosphatgruppe. Das Ziel der DNA-Sequenzierung ist es, die Reihenfolge aufzudecken, in der sich die vier stickstoffhaltigen Basen in der Sequenz befinden.

Geschichte

Mitte der 1950er Jahre beschrieben die Forscher Watson und Crick die Struktur der DNA mithilfe christolographischer Techniken. Keiner dieser Forscher hatte jedoch einen Weg gefunden, die Sequenz aufzudecken.

Obwohl es bestimmte Vorgänger gab, war das wichtigste Ereignis die Schaffung der Sanger-Methode im Jahr 1977. Frederick Sanger, der Vater der Methode, war ein britischer Biochemiker, der zwei Nobelpreise für seine enormen Beiträge zu den Biowissenschaften erhielt.

Diese Technik ist in der Literatur auch als "Kettenabbruch" oder Didesoxynukleotide bekannt. Die Prinzipien dieser Technik und diejenigen, die auf der Grundlage ihrer Verbesserung und Innovation entwickelt wurden, werden nachstehend beschrieben.

Sanger-Methode

Die Entwicklung der Sanger-Methode war ein entscheidendes Ereignis in der Molekularbiologie. Es umfasst die Grundkomponenten des DNA-Replikationsprozesses, der normalerweise in der Zelle stattfindet, fügt jedoch eine spezielle Komponente hinzu: Didesoxynukleotide.

Hauptkomponenten der Reaktion

- DNA-Polymerase: Das Enzym DNA-Polymerase ist ein entscheidendes Element des Prozesses. Dieses Molekül ist an der Replikation des DNA-Strangs beteiligt und seine Rolle ist die Synthese des neuen Strangs, wobei die Triphosphat-Desoxyribonukleotide mit den komplementären gepaart werden.

Denken Sie daran, dass sich Thymine (T) in der DNA über zwei Wasserstoffbrücken mit Adeninen (A) paaren, während Cytosin (C) dies mit Guanin (G) über drei Bindungen tut.

- Nukleotide: Die Sanger-Sequenzierung umfasst zwei Arten von Nukleotiden, die vier 2'-Desoxynukleotide (abgekürzt als dATP, dGTP, dCTP und dTTP) und die vier Didesoxynukleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP).

Obwohl Didesoxynukleotide den Monomeren ähnlich sind, die normalerweise in DNA eingebaut werden, fehlt ihnen eine -OH-Gruppe in ihrer Struktur. Dies macht es unmöglich, der Kette ein neues Nukleotid hinzuzufügen.

Wenn daher der Kette bei der Bildung ein spezielles Nukleotid auf völlig zufällige Weise hinzugefügt wird, ist die Synthese gelähmt. Somit gibt es am Ende der Reaktion Ketten unterschiedlicher Größe, von denen jede die Reaktion an einem anderen Punkt gestoppt hat.

Experimentell werden vier Tests vorbereitet. Jedes enthält die aus der interessierenden biologischen Probe extrahierte DNA, die normalen Nukleotide und einen der vier speziellen Nukleotidtypen. Entweder sind die speziellen Nukleotide mit einer Art fluoreszierendem Marker markiert (siehe automatisierte Sequenzierung unten).

Ergebnisse lesen

Der erste Schritt besteht darin, jede der synthetisierten Ketten nach ihrer Größe zu trennen. Einige sind länger als andere, je nachdem, wo die speziellen Basen eingebaut wurden.

Es gibt verschiedene biochemische Techniken, die die Trennung der Komponenten eines Gemisches unter Verwendung der Größe als diskriminierende Eigenschaft ermöglichen. Bei der Sanger-Methode werden die verschiedenen Ketten durch Elektrophorese getrennt. In den komplexeren Varianten der Technik wird die Kapillarelektrophorese verwendet.

Somit bewegen sich die längeren Stränge weniger als die kürzeren Varianten. Dieses System durchläuft dann einen Leser, der den in jedem Didesoxynukleotid enthaltenen Marker erkennt. Auf diese Weise kann die Reihenfolge der Sequenz bekannt sein.

Diese Technik der "ersten Generation" kann DNA-Fragmente lesen, die nicht größer als 1 Kilobase sind. Gegenwärtig wird die Sanger-Methode in verschiedenen Labors angewendet, im Allgemeinen in ihren modernen Varianten. Darüber hinaus wird es verwendet, um die mit den komplexesten Techniken erzielten Ergebnisse zu bestätigen - jedoch weniger genau.

Automatische Sequenzierung

Wenn eine Sequenzierung in großem Maßstab erforderlich ist, wird der Prozess durch Automatisierung beschleunigt. Dies ist eine Variation der Sanger-Kettenabbruchmethode, bei der die Primer mit fluoreszierenden Produkten markiert werden, um sie zu unterscheiden.

Anschließend wird das Reaktionsprodukt einer Elektrophorese unterzogen - alles auf einer einzigen Spur. Wenn jedes Fragment den letzten Teil des Gels verlässt, wird es schnell durch seine fluoreszierende Markierung identifiziert, wobei ein Fehler 1% umgibt.

Die fortschrittlichsten Systeme verfügen über ein System von bis zu 96 Kapillarröhrchen, die von einem an einen Roboter gekoppelten Computer verwaltet werden. Das heißt, 96 DNA-Proben können gleichzeitig getestet werden. Somit ist der Prozess der Elektrophorese und Analyse der Ergebnisse vollständig automatisiert.

An einem Tag können diese Systeme bis zu 550.000 Basen sequenzieren. Während des Prozesses ist keine menschliche Arbeit erforderlich, es dauert nur etwa 15 Minuten, um die Methode zu starten.

Maxam-Gilbert-Sequenzierung

Zur gleichen Zeit, als Sanger seine Arbeit veröffentlichte, gelang es zwei Forschern namens Allan Maxan und Walter Gilbert, eine andere Methode zu entwickeln, um die DNA-Sequenz zu erhalten. Die Methode gewann zu dieser Zeit an Popularität, wurde aber später durch die Verbesserung der Sanger-Methode verdrängt.

Im Gegensatz zur Sanger-Methode beinhaltet die Maxan- und Gilbert-Sequenzierung (oder die chemische Sequenzierung, wie sie auch genannt wird) keine Hybridisierungsreaktionen. Die Methode besteht aus der Markierung mit reaktiven Mitteln an einem Ende, gefolgt von einem Reinigungsprozess.

Einer der negativen Aspekte dieser Technik liegt in ihrer enormen Komplexität und in der Verwendung von Chemikalien, die für den Benutzer gefährlich sind. Chemische Brüche werden durch die Anwendung von DMS, Ameisensäure, Hydrazin und Hydrazin mit Salzen induziert.

Prozess

Das Protokoll beginnt mit der Markierung am 5'-Ende des Strangs mit dem Phosphormarker 32, dann erfolgt eine chemische Modifikation der Stickstoffbase und diese wird abgetrennt. Schließlich erfolgt die Spaltung der abasischen Region.

Zuerst kürzen Sie die Zeichenfolge, die Sie sequenzieren möchten, in kleinere Segmente. Dieser Schritt wird mit Restriktionsenzymen durchgeführt, die zu hervorstehenden Enden führen.

Als nächstes wird die Reaktion mit einer alkalischen Phosphatase durchgeführt, deren Zweck darin besteht, die Phosphatgruppe zu eliminieren. Somit kann eine Polynukleotidkinase verwendet werden, um die Markierung durchzuführen.

Die Kette ist denaturiert (die beiden Stränge öffnen sich). Dann werden die Chemikalien angewendet. Diese Spaltungsreaktionen werden auf kontrollierte Weise durchgeführt und es ist bekannt, welche Arten von Bindungen jede angewendete Chemikalie bricht.

Ergebnisse lesen

Wie bei der Sanger-Methode beinhaltet das Ablesen der Ergebnisse die Trennung der in einem Elektrophoresesystem erhaltenen Ketten nach Größe. Systeme aus Polyacrylamid ermöglichen eine sehr angemessene Auflösung zum Ablesen des Gels.

Massensequenzierung

Die massive Sequenzierung umfasst eine Reihe neuartiger Methoden, abgekürzt als NGS, aus der englischen "Next Generation Sequencing".

Die als NGS klassifizierten Methoden erfordern einen vorherigen DNA-Amplifikationsschritt (sie funktionieren nicht mit einem einzelnen Molekül). Darüber hinaus variieren die verwendeten Plattformen stark. Die Prinzipien der beliebtesten Methoden werden nachfolgend beschrieben:

Pyrosequenzierung

Dabei wird die Freisetzung eines Pyrophosphats überwacht, die jedes Mal auftritt, wenn dem DNA-Strang ein neues Nukleotid hinzugefügt wird. Ein Enzymsystem ist gekoppelt, so dass die Lichtemission (die von einer Kamera erfasst werden kann) jedes Mal auftritt, wenn ein neues Nukleotid eingebaut wird.

Der Prozess beginnt mit der getrennten Inkubation jeder Stickstoffbase, um zu überprüfen, ob Lichtemission vorliegt oder nicht. Pyrosequenzierung kann lange Stränge lesen, aber die gefundene Fehlerrate ist hoch.

Synthesesequenzierung

Dies beinhaltet den Einbau von markierten Nukleotiden. Diese fluoreszierenden Komponenten werden zugegeben, gewaschen und das eingebaute Nukleotid wird notiert. Dann wird die Nukleotidmarkierung entfernt und die Synthese des Strangs kann fortgesetzt werden. Im nächsten Schritt wird auch ein markiertes Nukleotid eingebaut und die vorgenannten Schritte werden wiederholt.

Ein Nachteil dieser Technik tritt auf, wenn die fluoreszierenden Marker nicht vollständig entfernt werden. Diese Emissionen verursachen Hintergrundfehler, die zu erheblichen Fehlern führen.

Ligationssequenzierung

Diese Technik unterscheidet sich von den anderen, da keine DNA-Polymerase verwendet wird. Stattdessen ist das Schlüsselenzym für diese Methode die Ligase. Hier werden fluoreszenzmarkierte DNA-Fragmente verwendet, die durch das Enzym verknüpft und nachgewiesen werden.

Das größte Problem bei dieser Technik ist die kurze Fragmentlänge, die sie verarbeiten kann.

Ionen-Torrent-Sequenzierung

Diese Technik basiert auf der Messung des H ⁺ -Ions , das jedes Mal freigesetzt wird, wenn ein neues Nukleotid eingebaut wird. Das Prinzip ist der Pyrosequenzierung ziemlich ähnlich, aber viel billiger.

Beispiele

Die Sequenzierung des menschlichen Genoms

Die Sequenzierung des menschlichen Genoms war eine der vielversprechendsten Herausforderungen in der Biologie und eine der bekanntesten Rivalitäten in der Geschichte der Wissenschaft. Für die an dem Projekt beteiligten Wissenschaftler wurde die Sequenzierung des Genoms zu einem Wettbewerb.

1990 startete er das sogenannte "Humangenomprojekt" unter der Leitung des berühmten Wissenschaftlers, des Nobelpreisträgers James Watson. Nach einem Jahr, 1991, stellt sich Venter der Herausforderung, Watson zu "schlagen" und das Genom vor ihm zu sequenzieren. 1992 zog sich Watson jedoch zurück und das Kommando wurde von einem anderen Forscher übernommen.

1995 gab Venter seinen Erfolg bei der vollständigen Sequenzierung eines Bakteriengenoms durch die Zufallssequenzierungsmethode bekannt. Ebenso kündigte das gegnerische Team ein Jahr später die Sequenzierung des Hefegenoms an.

Im Jahr 2000 wurde das Studium beendet. Beide Unternehmen veröffentlichten ihre vorläufigen Ergebnisse des gesamten Genoms in zwei der renommiertesten Fachzeitschriften der Wissenschaft: Nature and Science.

Die Wissenschaftler arbeiteten jedoch weiter an der Verbesserung der Vorschläge, und 2006 wurden die Sequenzen bestimmter menschlicher Chromosomen fertiggestellt.

Bedeutung und Anwendungen

Die Kenntnis der Reihenfolge der Nukleotide eines so wichtigen Moleküls wie DNA ist für Biologen und verwandte Fachleute wertvoll. Diese Kette von Polynukleotiden enthält alle Informationen, die für die Entwicklung und Aufrechterhaltung aller Lebensformen erforderlich sind.

Aus diesen Gründen ist die Kenntnis dieser Sequenz für die biologische Forschung unerlässlich. Grundsätzlich ermöglicht die Sequenzierung, eine der wichtigsten Eigenschaften biologischer Systeme zu messen und Unterschiede zwischen ihnen festzustellen.

Die Sequenzierung wird von Taxonomen und Systematikern häufig verwendet, da bestimmte DNA-Sequenzen die Festlegung von Kriterien ermöglichen, um zu schließen, ob zwei Organismen zur gleichen Art gehören oder nicht, und außerdem Hypothesen über die phylogenetischen Beziehungen zwischen ihnen vorschlagen können.

Darüber hinaus findet die DNA-Sequenzierung Anwendung in der Medizin und Diagnostik. Zum Beispiel gibt es kostengünstige und zugängliche Systeme, die mittels Sequenzierung die Bewertung der Tendenz zur Entwicklung bestimmter Krankheiten (wie Krebs) unter Verwendung der sogenannten Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) ermöglichen.

Untersuchungen des kriminellen und forensischen Typs wurden auch mit Sequenzierungstechniken angereichert, die als verlässlicher Beweis für die Beteiligung einer bestimmten Person an einer Straftat dienen können.

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