Der TCBS-Agar ist ein Mittel zur hochselektiven und differenziellen Festkultur, das zur Isolierung und Kultivierung von Bakterien der Gattung Vibrio, insbesondere Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus und V. vulnificus, als Hauptpathogene dieser Art verwendet wird.
Das Akronym TCBS steht für Thiosulfate Citrate Bile Sucrose. Dieser Agar ist auch als selektives Medium für Vibrios bekannt. Die ursprüngliche Formel wurde von Nakanishi erstellt und später von Kobayashi modifiziert.
Kommerzielles TCBS-Medium und TCBS-Agarplatte, ausgesät mit Vibrio cholerae. Quelle: Foto 1: aufgenommen vom Autor MSc. Marielsa Gil / Foto 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, Indien
Es besteht aus Hefeextrakt, Fleischpepton, Triptein, Natriumcitrat, Natriumthiosulfat, Ochsengalle, Saccharose, Natriumchlorid, Eisen (III) -citrat, Bromthymolblau, Thymolblau und Agar.
Diese Zusammensetzung ermöglicht eine adäquate Entwicklung von Vibrio-Arten aus Wasser-, Lebensmittel- und Kotproben; mit Ausnahme von Vibrio hollisae, die auf diesem Medium nicht wächst. Darüber hinaus kann TCBS-Medium das Wachstum anderer begleitender Bakterien, insbesondere von Coliformen, hemmen.
Aufgrund der schwerwiegenden gastrointestinalen und extraintestinalen Probleme, die bei einigen Arten der Gattung Vibrio auftreten, ist die Diagnose sehr wichtig. Menschen sind hauptsächlich durch den Verzehr von rohen oder ungekochten Lebensmitteln aus dem Meer oder verschmutzten Gewässern infiziert, aber auch durch Wundinfektionen.
Aus diesem Grund müssen klinische Laboratorien TCBS-Agar in die Stuhlkulturstudie mit flüssigen Stuhlproben einbeziehen, insbesondere mit dem Auftreten von Reiswasser. Insbesondere, wenn der Patient angibt, mit Meerwasser in Kontakt gekommen zu sein oder Schalentiere oder Fische verzehrt zu haben.
Basis
Hefeextrakt, Fleischpeptonen und Triptein sind die Nahrungsquelle dieses Mediums. TCBS-Agar ist jedoch für die meisten Bakterien ein unwirtliches Medium.
Seine hohe Selektivität ergibt sich aus der Zugabe von Natriumcitrat und Ochsengalle; beide sind Hemmstoffe, die dem Medium auch einen alkalischen pH-Wert verleihen, das Wachstum der begleitenden Flora einschränken und unter anderem das Wachstum von V. cholerae begünstigen. Es ist zu beachten, dass Vibrio cholerae sehr säureempfindlich ist.
Natriumchlorid seinerseits gleicht das Medium osmotisch aus. Da seine Konzentration hoch ist, wirkt es außerdem als Hemmstoff und begünstigt das Wachstum von halophilen Bakterien.
Saccharose ist der fermentierbare Zucker, der zusammen mit den pH-Indikatoren Bromthymolblau und Thymolblau dem Medium seinen unterschiedlichen Charakter verleiht. Aus diesem Grund ist es mit diesem Medium möglich, Saccharose-fermentierende Stämme von nicht fermentierenden zu unterscheiden.
Kolonien von Saccharose-fermentierenden Stämmen entwickeln eine gelbe Farbe und wandeln das Medium aufgrund der Säureproduktion von grün nach gelb. Die Nichtfermenter werden durchscheinend und das Medium behält die ursprüngliche Farbe (grün).
Ebenso enthält dieses Medium Natriumthiosulfat als Schwefelquelle und Eisen (III) -citrat als Entwicklungsmittel. Beide zeigen Bakterien, die Schwefelwasserstoff (farbloses Gas) produzieren können. H 2 S wird aus Thiosulfat gebildet und anschließend bildet sich bei Reaktion mit Eisen (III) -citrat ein sichtbarer schwarzer Niederschlag.
Schließlich verleiht der Agar dem Medium die feste Konsistenz.
Vorbereitung
89 g des dehydrierten Mediums werden gewogen und in einem Liter destilliertem Wasser gelöst. Helfen Sie beim Auflösen durch Erhitzen und häufiges Rühren. Die Mischung kann bis zu 2 Minuten gekocht werden.
Dieses Medium wird nicht autoklaviert. Nach dem Auflösen wird es direkt auf sterilen Platten serviert. Wenn sie sich verfestigen, werden sie umgekehrt auf Blutplättchen angeordnet und bis zur Verwendung im Kühlschrank (2-8 ° C) aufbewahrt.
Das Medium muss nach der Herstellung bei pH 8,6 ± 0,2 bleiben.
Die Farbe des dehydrierten Mediums ist hellbeige oder grünlich-beige, und die Farbe des Mediums ist waldgrün oder bläulichgrün.
Es ist wichtig, dass sich die Platten vor dem Aussäen der Proben erwärmen.
Verwenden
Die häufigste Probe für die Vibrios-Isolierung ist der Durchfall-Stuhl.
Stuhlproben sollten auf dem Cary Blair-Medium transportiert werden, wenn sie nicht sofort auf das selektive Medium ausgesät werden können.
Um die Empfindlichkeit der Kultur zu erhöhen, können Fäkalien für maximal 8 Stunden als Anreicherungsmedium durch Peptonwasser bei pH 8,4 geleitet werden, von dort wird es in TCBS-Medium subkultiviert.
Es muss auch berücksichtigt werden, dass einige Vibrios-Stämme bei immunsupprimierten Patienten eine Septikämie verursachen können, weshalb sie aus Blutkulturen isoliert werden können. Ebenso können Wasser- und Lebensmittelproben aus dem Meer analysiert werden, wenn es zu epidemischen Ausbrüchen der Cholera kommt.
Gesät
Das Inokulum der Untersuchungsprobe muss hervorstehen, die Aussaat erfolgt nach der Streifenmethode durch Erschöpfung. Die Platten werden 24 Stunden bei 37 ° C in Aerobiose inkubiert.
Die mutmaßlichen Kolonien von Vibrio cholerae sind mittelgroß, glatt, undurchsichtig, haben dünne Ränder und sind aufgrund der Fermentation von Saccharose gelb gefärbt.
Die Arten von V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii und einigen V. vulnificus wachsen auf ähnliche Weise. Andere klinisch wichtige Vibrios-Arten wie V. parahaemolyticus fermentieren keine Saccharose und entwickeln sich zu olivgrünen Kolonien.
TCBS-Agarplatte mit Vibrio parahaemolyticus. Quelle: isis325 Flickr
Andererseits muss berücksichtigt werden, dass einige Stämme von Aeromonas und Plesiomonas, die Oxidase (+) sind, in diesem Medium wachsen und gelbe Kolonien entwickeln können, die den Kliniker verwirren können. Während einige Pseudomonas-Stämme auch Oxidase (+) als grüne Kolonien wie V. parahaemolyticus wachsen.
Einschränkung
Der Oxidase-Test, der für die Gattung Vibrio positiv ist, sollte niemals an Kolonien durchgeführt werden, die aus TCBS-Agar erhalten wurden, da das erhaltene Ergebnis falsch negativ ist. Verbindungen in der Mitte stören diesen Test stark. Daher muss es aus Subkulturen auf Blutagar hergestellt werden.
QA
Um zu beweisen, dass sich das Medium in einem guten Zustand befindet, ist es ratsam, bekannte oder zertifizierte Kontrollstämme zu säen und zu beobachten, ob das Wachstum die erwarteten Eigenschaften erfüllt.
Hierfür können Sie Stämme verwenden von:
-Vibrio cholerae -– zufriedenstellendes Wachstum (gelbe Kolonien, durchscheinender Rand).
-Vibrio parahaemolyticus --– zufriedenstellendes Wachstum (Kolonie mit grünem Zentrum und durchscheinendem Rand).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - zufriedenstellendes Wachstum (gelbe Kolonien mit gleichfarbigen Lichthöfen um die Kolonie).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - vollständige oder teilweise Hemmung (kleine gelbe oder durchscheinende Kolonien).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-– teilweise oder vollständige Hemmung (blaue Kolonien).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Vollständig gehemmt.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– Vollständige oder teilweise Hemmung. (Kleine Kolonien grüne Mitte durchscheinende Grenze).
Die Inkubation von nicht geimpftem Medium sollte unverändert bleiben.
Verweise
- Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories. TCBS-Agar. 2009.Verfügbar unter: f-soria.es
- BD Labor. BD. TCBS Agar 2003. Verfügbar unter: bd.com
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