ZYTOCHEMIE: GESCHICHTE, UNTERSUCHUNGSGEGENSTAND, NUTZEN UND TECHNIKEN - BIOLOGIE - 2025

Die Zytochemie umfasst eine Reihe von Techniken, die auf der Identifizierung und Anordnung bestimmter Substanzen in der Zelle beruhen. Es wird als ein Zweig der Zellbiologie angesehen, der Zellmorphologie mit chemischer Struktur kombiniert.

Laut Bensley, Begründer der Anwendung der modernen Zytologie, drückt der Zweck der Zytochemie aus, die chemische Organisation von Zellen zu entdecken, um die Geheimnisse des Lebens zu verstehen. Neben der Untersuchung der dynamischen Veränderungen, die während der verschiedenen Funktionsstufen auftreten.

1: Paget's extramammäre Krankheit. (Hämatoxylin-Eosin) 2: senile Plaques in der Großhirnrinde bei einem Patienten mit Alzheimer-Krankheit. (Silberimprägnierung) 3: Kaninchenzunge, Kollagenfasern (blau). Muskelfasern (lila Streifen). (Massons Trichrom). 4: Lebergewebe mit Fettabbau. (Sudan III) 5: Entzündete Leber. Nekrose. (Toluidinblau) Quellen: Wikipedia. com / Benutzer: KGH / Public Domain-Dateien / Mohit Lalwani

Auf diese Weise ist es möglich, die metabolische Rolle dieser Substanzen innerhalb der Zelle zu bestimmen.

Die Zytochemie verwendet zwei Hauptmethoden. Die erste basiert auf chemischen und physikalischen Verfahren. Diese Techniken greifen auf die Verwendung des Mikroskops als unverzichtbares Instrument zur Visualisierung der chemischen Reaktionen zurück, die an bestimmten Substanzen in der Zelle auftreten.

Beispiel: Verwendung von zytochemischen Farbstoffen, unter anderem der Feulgen-Reaktion oder der PAS-Reaktion.

Die zweite Methode basiert auf Biochemie und Mikrochemie. Mit dieser Methode ist es möglich, das Vorhandensein intrazellulärer Chemikalien quantitativ zu bestimmen.

Unter den Substanzen, die in einer Gewebe- oder Zellstruktur nachgewiesen werden können, sind die folgenden: Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide und Lipide.

Geschichte der Zytochemie

Seit ihrer Erfindung haben zytochemische Techniken zum Verständnis der Zusammensetzung von Zellen beigetragen, und im Laufe der Zeit hat sich eine Vielzahl von Techniken herausgebildet, die verschiedene Arten von Farbstoffen mit unterschiedlichen Affinitäten und Grundlagen verwenden.

Anschließend eröffnete die Zytochemie mit der Verwendung bestimmter Substrate neue Horizonte, um kolorimetrisch das Vorhandensein von Enzymen oder anderen Molekülen in der Zelle zu zeigen.

Ebenso sind andere Techniken wie die Immunzytochemie entstanden, die bei der Diagnose vieler Krankheiten eine große Hilfe waren. Die Immunzytochemie basiert auf Antigen-Antikörper-Reaktionen.

Andererseits hat die Zytochemie auch fluoreszierende Substanzen verwendet, die als Fluorochrome bezeichnet werden und ausgezeichnete Marker für den Nachweis bestimmter Zellstrukturen sind. Aufgrund der Eigenschaften von Fluorochrom werden die Strukturen hervorgehoben, an die es gebunden wurde.

Was studierst du?

Die verschiedenen zytochemischen Techniken, die an einer biologischen Probe angewendet werden, haben etwas gemeinsam: Sie zeigen das Vorhandensein eines bestimmten Substanztyps und kennen dessen Position innerhalb der zu bewertenden biologischen Struktur, sei es ein Zelltyp oder ein Gewebe.

Diese Substanzen können Enzyme, Schwermetalle, Lipide, Glykogen und definierte chemische Gruppen (Aldehyde, Tyrosin usw.) sein.

Die durch diese Techniken bereitgestellten Informationen können nicht nur als Anleitung zur Identifizierung von Zellen, sondern auch zur Diagnose verschiedener Pathologien dienen.

Beispielsweise sind zytochemische Färbungen sehr nützlich bei der Unterscheidung zwischen den verschiedenen Arten von Leukämien, da einige Zellen bestimmte Enzyme oder Schlüsselsubstanzen exprimieren und andere nicht.

Andererseits sollte beachtet werden, dass die folgenden Überlegungen berücksichtigt werden müssen, damit die Verwendung der Zytochemie möglich ist:

1) Der Stoff muss an dem Ort immobilisiert werden, an dem er natürlich vorkommt.

2) Der Stoff muss anhand von Substraten identifiziert werden, die spezifisch mit ihm und nicht mit anderen Verbindungen reagieren.

Nützlichkeit

Die Proben, die mit zytochemischen Techniken untersucht werden können, sind:

- Erweitertes peripheres Blut.

- Erweitertes Knochenmark.

- Für histochemische Techniken fixierte Gewebe.

- Durch Zytozentrifugation fixierte Zellen.

Zytochemische Techniken sind auf dem Gebiet der Hämatologie sehr hilfreich, da sie häufig zur Diagnose und Differenzierung bestimmter Arten von Leukämien eingesetzt werden.

Zum Beispiel: Esterase-Reaktionen werden verwendet, um myelomonozytische Leukämie von akuter monozytischer Leukämie zu unterscheiden.

Das Knochenmark und die peripheren Blutausstriche dieser Patienten sind ähnlich, da einige Zellen nur morphologisch schwer zu identifizieren sind. Hierzu wird der Esterasetest durchgeführt.

In der ersten sind spezifische Esterasen positiv, während in der zweiten unspezifische Esterasen positiv sind.

Sie sind auch in der Histologie sehr nützlich, da beispielsweise die Verwendung der Schwermetallfärbetechnik (Silberimprägnierung) die retikulären Fasern im Myokardgewebe von einer intensiven braunen Farbe färbt.

Techniken in der Zytochemie

Die am häufigsten verwendeten Techniken werden nachfolgend erläutert:

- Verwendung von Farbstoffen

Die verwendeten Färbungen sind in zytochemischen Techniken sehr unterschiedlich und können nach verschiedenen Gesichtspunkten klassifiziert werden:

Nach dem Radikal, für das sie eine Affinität haben

Sie sind unterteilt in: sauer, basisch oder neutral. Sie sind die einfachsten und am häufigsten verwendeten im Laufe der Geschichte, sodass wir die basophilen von den acidophilen Komponenten unterscheiden können. Beispiel: Hämatoxylin-Eosin-Färbung.

In diesem Fall färben sich die Zellkerne blau (sie nehmen Hämatoxylin, das die Grundfärbung ist) und die Zytoplasmen rot (sie nehmen Eosin, das die Säurefärbung ist).

Je nach Farbe bieten sie

Sie können orthochromatisch oder metachromatisch sein. Die Orthochromatik färbt die Strukturen mit der gleichen Farbe wie der Farbstoff. Zum Beispiel der Fall von Eosin, dessen Farbe rot ist und rot färbt.

Andererseits färben Metachromatika Strukturen in einer anderen Farbe als ihre, wie zum Beispiel Toluidin, dessen Farbe blau ist und dennoch violett färbt.

Vital- oder Supravitalfarbstoffe

Sie sind harmlose Farbstoffe, das heißt, sie färben Zellen und bleiben am Leben. Diese Färbungen werden als vital (z. B. Trypanblau zur Färbung von Makrophagen) oder supravital (z. B. Janusgrün zur Färbung von Mitochondrien oder Neutralrot zur Färbung von Lysosomen) bezeichnet.

- Nachweis von Lipiden mittels fettlöslicher Farbstoffe

Osmiumtetroxid

Es färbt Lipide (ungesättigte Fettsäuren) schwarz. Diese Reaktion kann mit dem Lichtmikroskop beobachtet werden, aber da dieser Farbstoff eine hohe Dichte aufweist, kann er auch mit einem Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden.

Sudan III

Es ist eines der am häufigsten verwendeten. Dieser Farbstoff diffundiert und löst sich im Gewebe und sammelt sich in den Lipidtröpfchen an. Die Farbe ist scharlachrot.

Sudan schwarzer Fleck B.

Es erzeugt einen besseren Kontrast als die vorherigen, da es sich auch in Phospholipiden und Cholesterin auflösen kann. Es ist nützlich zum Nachweis von azurophilen und spezifischen Granulaten reifer Granulozyten und ihrer Vorläufer. Daher identifiziert es myeloische Leukämien.

- Aldehydgruppenfärbung (periodische Schiffsche Färbung)

Periodische Säure-Schiff-Färbung kann drei Arten von Aldehydgruppen nachweisen. Sie sind:

- Freie Aldehyde, die natürlicherweise im Gewebe vorhanden sind (Plasmareaktion).

- Aldehyde, die durch selektive Oxidation (PAS-Reaktion) hergestellt werden.

- Durch selektive Hydrolyse erzeugte Aldehyde (Feulgen-Reaktion).

PAS-Reaktion

Diese Färbung basiert auf dem Nachweis bestimmter Arten von Kohlenhydraten, wie z. B. Glykogen. Periodsäure Schiff bricht die CC-Bindungen von Kohlenhydraten aufgrund der Oxidation der Glykolgruppen 1-2 und schafft so die Freisetzung von Aldehydgruppen.

Freie Aldehydgruppen reagieren mit dem Schiffschen Reagenz und bilden eine purpurrote Verbindung. Das Auftreten der purpurroten Farbe zeigt eine positive Reaktion.

Dieser Test ist positiv in Pflanzenzellen, die Stärke, Cellulose, Hemicellulose und Peptide nachweisen. In tierischen Zellen werden Mucine, Mucoproteine, Hyaluronsäure und Chitin nachgewiesen.

Darüber hinaus ist es nützlich bei der Diagnose von lymphoblastischen Leukämien oder Erythroleukämie, unter anderen Pathologien vom myelodysplastischen Typ.

Bei sauren Kohlenhydraten kann die Alcianblau-Färbung verwendet werden. Der Test ist positiv, wenn eine hellblaue / türkise Farbe beobachtet wird.

Plasmale Reaktion

Die Plasmareaktion zeigt das Vorhandensein bestimmter langkettiger aliphatischer Aldehyde wie Palme und Stearal. Diese Technik wird auf gefrorene histologische Schnitte angewendet. Es wird direkt mit dem Schiffschen Reagenz behandelt.

Feulgen-Reaktion

Diese Technik erkennt das Vorhandensein von DNA. Die Technik besteht darin, das fixierte Gewebe einer schwachen Säurehydrolyse zu unterziehen, um es später mit dem Schiffschen Reagenz reagieren zu lassen.

Durch Hydrolyse werden die Desoxyribosealdehydgruppen an der Desoxyribose-Purin-Bindung freigelegt. Das Schiffsche Reagenz reagiert dann mit den Aldehydgruppen, die frei gelassen wurden.

Diese Reaktion ist in den Kernen positiv und in den Zytoplasmen der Zellen negativ. Positivität wird durch das Vorhandensein einer roten Farbe angezeigt.

Wenn diese Technik mit Methylgrünpyronin kombiniert wird, ist es möglich, DNA und RNA gleichzeitig nachzuweisen.

- Zytochemische Färbungen für Proteinstrukturen

Hierzu kann die Millon-Reaktion verwendet werden, bei der Quecksilbernitrat als Reagenz verwendet wird. Strukturen, die aromatische Aminosäuren enthalten, färben sich rot.

- Zytochemische Färbungen, bei denen Substrate verwendet werden, um das Vorhandensein von Enzymen anzuzeigen

Diese Färbungen beruhen auf der Inkubation der biologischen Probe mit einem bestimmten Substrat und das Reaktionsprodukt reagiert anschließend mit Diazosalzen unter Bildung eines gefärbten Komplexes.

Esterasen

Diese Enzyme sind in den Lysosomen einiger Blutzellen vorhanden und können organische Ester hydrolysieren, wobei Naphthol freigesetzt wird. Letzterer bildet einen unlöslichen Azofarbstoff, wenn er an ein Diazosalz bindet und die Stelle färbt, an der die Reaktion stattfindet.

Es gibt mehrere Substrate und je nachdem, welches verwendet wird, können spezifische Esterasen und unspezifische Esterasen identifiziert werden. Ersteres ist in unreifen Zellen der myeloischen Reihe und letzteres in Zellen monozytischen Ursprungs vorhanden.

Das zur Bestimmung spezifischer Esterasen verwendete Substrat ist: Naphthol-AS-D-Chloracetat. Während zur Bestimmung unspezifischer Esterasen verschiedene Substrate verwendet werden können, wie Naphthol-AS-D-Acetat, Alpha-Naphthylacetat und Alpha-Naphthylbutyrat.

In beiden Fällen färben sich die Zellen bei positiver Reaktion tiefrot.

Myeloperoxidase

Dieses Enzym kommt im azurophilen Granulat von Granulozytenzellen und Monozyten vor.

Sein Nachweis wird verwendet, um Leukämien myeloischen Ursprungs von lymphoiden zu unterscheiden. Zellen, die Myeloperoxidasen enthalten, werden ockergelb.

Phosphatasen

Diese Enzyme setzen Phosphorsäuren von verschiedenen Substraten frei. Sie unterscheiden sich hinsichtlich der Spezifität des Substrats, des pH-Werts und der Wirkung von Inhibitoren und Inaktivatoren.

Zu den bekanntesten gehören die Phosphomonoesterasen, die einfache Ester (PO) hydrolysieren. Beispiel: alkalische Phosphatase und saure Phosphatase sowie Phosphamidasen, die die Bindungen hydrolysieren (PN). Diese werden zur Unterscheidung von lymphoproliferativen Syndromen und zur Diagnose von Haarzellenleukämie eingesetzt.

- Trichrome Färbungen

Mallary-Azan-Trichrom

Sie sind nützlich, um das Zytoplasma von Zellen von den Fasern des Bindegewebes zu unterscheiden. Zellen färben sich rot und Kollagenfasern blau.

Massons Trichrom

Dies hat den gleichen Nutzen wie das vorherige, aber in diesem Fall färben sich die Zellen rot und die Kollagenfasern grün.

- Farbstoffe, die bestimmte Organellen färben

Janus Green

Es färbt selektiv die Mitochondrien.

Silbersalze und Osminsäure

Befleckt den Golgi-Apparat.

Toluidinblau

Befleckt Nissis Körper

Silbersalze und PAS

Sie färben die Netzfasern und die Basallamina.

Orcein und Fuchsin Resorcin

Sie färben elastische Fasern. Beim ersten sind sie braun gefärbt und beim zweiten tiefblau oder lila.

- Andere in der Zytochemie verwendete Techniken

Verwendung fluoreszierender Substanzen oder Fluorochrome

Es gibt Techniken, die fluoreszierende Substanzen verwenden, um den Ort einer Struktur in einer Zelle zu untersuchen. Diese Reaktionen werden mit einem speziellen Mikroskop namens Fluoreszenz sichtbar gemacht. Beispiel: IFI-Technik (Indirekte Immunfluoreszenz).

Nachweis von Zellbestandteilen durch Immunzytochemie

Diese Techniken sind in der Medizin sehr nützlich, da sie helfen, eine bestimmte Zellstruktur zu erkennen und auch zu quantifizieren. Diese Reaktion basiert auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Zum Beispiel: ELISA-Techniken (Enzyme Immuno Assay).

Empfehlungen

- Es ist notwendig, Kontrollabstriche zu verwenden, um die gute Leistung der Farbstoffe zu bewerten.

- Für eine zytochemische Färbung sollten frische Abstriche verwendet werden. Wenn nicht möglich, sollten sie vor Licht geschützt und bei 4 ° C gelagert werden.

- Es ist darauf zu achten, dass das verwendete Fixiermittel den zu untersuchenden Stoff nicht negativ beeinflusst. Mit anderen Worten, es muss verhindert werden, dass es extrahiert oder inhibiert werden kann.

- Die Verwendungszeit der Fixiermittel muss eingehalten werden, da sie im Allgemeinen nur Sekunden dauern sollte, da das längere Aussetzen des Abstrichs dem Fixiermittel einige Enzyme schädigen kann.

Verweise

1. "Zytochemie." Wikipedia, die freie Enzyklopädie. 30. Juni 2018, 17:34 UTC. 9. Juli 2019, 02:53 Verfügbar in: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Metallische Imprägnierungsmethoden zur Untersuchung von myokardialen retikulären Fasern: Vergleichsstudie. RFM 2002; 25 (2): 224 & ndash; 230. Verfügbar unter: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martin M, Molero T. Zytochemie der sauren Phosphatase: methodische Überlegungen. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89 & ndash; 92. Verfügbar unter: scielo.org
4. De Robertis E., De Robertis M. (1986). Zell- und Molekularbiologie. 11. Auflage. Editorial Ateneo. Buenos Aires, Argentinien.
5. Klassische Werkzeuge zum Studium der Zellbiologie. TP 1 (Zusatzmaterial) - Zellbiologie. Verfügbar unter: dbbe.fcen.uba.ar