DNA-MICROARRAYS: VERFAHREN UND ANWENDUNGEN - BIOLOGIE - 2025

Ein DNA-Microarray , auch DNA-Chip oder DNA-Microarray genannt, besteht aus einer Reihe von DNA-Fragmenten, die auf einem physischen Träger aus variablem Material, entweder Kunststoff oder Glas, verankert sind. Jedes DNA-Stück repräsentiert eine Sequenz, die zu einem bestimmten Gen komplementär ist.

Das Hauptziel von Microarrays ist die vergleichende Untersuchung der Expression bestimmter interessierender Gene. Beispielsweise ist es üblich, dass diese Technik auf zwei Proben angewendet wird - eine unter gesunden und eine pathologische -, um zu identifizieren, welche Gene exprimiert werden und welche nicht in der Probe mit der Bedingung sind. Diese Probe kann eine Zelle oder ein Gewebe sein.

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Im Allgemeinen kann die Expression von Genen dank der Verwendung fluoreszierender Moleküle nachgewiesen und quantifiziert werden. Die Manipulation der Chips erfolgt meist per Roboter und eine Vielzahl von Genen kann gleichzeitig analysiert werden.

Diese neuartige Technologie eignet sich für eine Vielzahl von Disziplinen, von der medizinischen Diagnostik bis zu verschiedenen molekularbiologischen Studien auf den Gebieten der Proteomik und Genomik.

Woraus besteht es?

DNA-Mikroarrays (Desoxyribonukleinsäure) sind ein Satz spezifischer DNA-Segmente, die an eine feste Matrix gebunden sind. Diese Sequenzen ergänzen die Gene, die untersucht werden sollen, und es können bis zu 10.000 Gene pro cm ^{2 vorhanden sein} .

Diese Eigenschaften ermöglichen die systematische und umfassende Untersuchung der Genexpression eines Organismus.

Die Informationen, die eine Zelle benötigt, um zu funktionieren, werden in Einheiten codiert, die als "Gene" bezeichnet werden. Bestimmte Gene enthalten Anweisungen zur Erzeugung essentieller biologischer Moleküle, die als Proteine ​​bezeichnet werden.

Ein Gen wird exprimiert, wenn seine DNA in ein intermediäres Messenger-RNA-Molekül transkribiert wird und die Expression des Gens in Abhängigkeit vom Transkriptionsgrad dieses DNA-Segments variieren kann. In bestimmten Fällen kann die Änderung der Expression auf Krankheiten hinweisen.

Das Prinzip der Hybridisierung ermöglicht den Betrieb von Microarrays. DNA ist ein Molekül, das aus vier Arten von Nukleotiden besteht: Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin.

Zur Bildung der Doppelhelixstruktur werden Adeningruppen mit Thymin und Cytosin mit Guanin gebildet. Somit können zwei komplementäre Ketten durch Wasserstoffbrücken verbunden werden.

Arten von Microarrays

In Bezug auf die Struktur der Microarrays gibt es zwei Variationen: die maßgeschneiderte komplementäre DNA oder Oligonukleotide und die kommerziellen Microarrays mit hoher Dichte, die von kommerziellen Unternehmen wie Affymetrix GeneChip hergestellt werden.

Der erste Typ eines Microarrays ermöglicht die Analyse von RNA aus zwei verschiedenen Proben auf einem einzelnen Chip, während die zweite Variante vom kommerziellen Typ ist und eine große Anzahl von Genen aufweist (zum Beispiel hat der Affymetrix GeneChip etwa 12.000 menschliche Gene), die eine Analyse ermöglichen eine einzelne Probe.

Prozess

RNA-Isolierung

Der erste Schritt bei der Durchführung eines Experiments unter Verwendung der Microarray-Technologie ist die Isolierung und Reinigung der RNA-Moleküle (es kann sich um Messenger-RNA oder andere Arten von RNA handeln).

Wenn Sie zwei Proben vergleichen möchten (unter anderem gesund gegen krank, Kontrolle gegen Behandlung), muss die Isolierung des Moleküls in beiden Geweben durchgeführt werden.

Herstellung und Markierung von cDNA

Anschließend wird die RNA in Gegenwart markierter Nukleotide einem reversen Transkriptionsprozess unterzogen und somit die komplementäre DNA oder cDNA erhalten.

Die Markierung kann fluoreszierend sein und muss zwischen den beiden zu analysierenden Geweben unterscheidbar sein. In herkömmlicher Weise werden die fluoreszierenden Verbindungen Cy3 und Cy5 verwendet, da sie Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen emittieren. Im Fall von Cy3 ist es eine Farbe nahe Rot und Cy5 entspricht dem Spektrum zwischen Orange und Gelb.

Hybridisierung

Die cDNAs werden gemischt und in dem DNA-Mikroarray inkubiert, um eine Hybridisierung (dh eine Bindung tritt) der cDNA aus beiden Proben mit dem auf der festen Oberfläche des Mikroarrays immobilisierten Teil der DNA zu ermöglichen.

Ein höherer Prozentsatz der Hybridisierung mit der Sonde im Microarray wird als höhere Gewebeexpression der entsprechenden mRNA interpretiert.

System lesen

Die Quantifizierung der Expression erfolgt durch Einbau eines Lesesystems, das der von jeder cDNA emittierten Fluoreszenzmenge einen Farbcode zuweist. Wenn beispielsweise Rot verwendet wird, um den pathologischen Zustand zu markieren, und es in einem höheren Anteil hybridisiert, ist die rote Komponente die vorherrschende.

Mit diesem System kann die Überexpression oder Repression jedes unter beiden ausgewählten Bedingungen analysierten Gens bekannt sein. Mit anderen Worten kann das Transkriptom der im Experiment bewerteten Proben bekannt sein.

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Anwendungen

Derzeit gelten Microarrays als sehr leistungsfähige Werkzeuge im medizinischen Bereich. Diese neue Technologie ermöglicht die Diagnose von Krankheiten und ein besseres Verständnis dafür, wie die Genexpression unter verschiedenen medizinischen Bedingungen verändert wird.

Darüber hinaus ermöglicht es den Vergleich eines Kontrollgewebes mit einem mit einem bestimmten Arzneimittel behandelten Gewebe, um die Auswirkungen einer möglichen medizinischen Behandlung zu untersuchen.

Dazu werden der Normalzustand und der Krankheitszustand vor und nach der Verabreichung des Arzneimittels verglichen. Indem wir die Wirkung des Arzneimittels auf das Genom in vivo untersuchen, haben wir einen besseren Überblick über seinen Wirkungsmechanismus. Es kann auch verstanden werden, warum bestimmte Medikamente zu unerwünschten Nebenwirkungen führen.

Krebs

Krebs führt die Liste der mit DNA-Microarrays untersuchten Krankheiten an. Diese Methode wurde zur Klassifizierung und Prognose der Krankheit verwendet, insbesondere bei Leukämien.

Das Untersuchungsgebiet dieses Zustands umfasst die Kompression und Charakterisierung der molekularen Basen von Krebszellen, um Muster der Genexpression zu finden, die zu Fehlern bei der Regulation des Zellzyklus und bei den Prozessen des Zelltods (oder der Apoptose) führen.

Andere Krankheiten

Durch die Verwendung von Microarrays war es möglich, die unterschiedlichen Expressionsprofile von Genen bei Erkrankungen von Allergien, primären Immundefekten, Autoimmunerkrankungen (wie rheumatoider Arthritis) und Infektionskrankheiten aufzuklären.

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