PHOSPHATPUFFER (PBS): BEGRÜNDUNG, HERSTELLUNG UND VERWENDUNG - BIOLOGIE - 2025

Der Phosphatpuffer, die phosphatgepufferte Salzlösung oder das BPS ist ein isotonischer Puffer, dessen Funktion darin besteht , den pH-Wert und den osmotischen Druck so nahe wie möglich an der natürlichen biologischen Umgebung (physiologisch) zu halten. Das Akronym PBS steht für phosphatgepufferte Kochsalzlösung.

PH und Osmolarität sind zwei sehr wichtige Aspekte, die in bestimmten Laborprotokollen kontrolliert werden müssen. Im Falle des pH-Werts ist es wichtig, dass er kontrolliert wird, insbesondere bei biochemischen Reaktionen, da diese variieren können oder nicht durchgeführt werden, wenn die Reaktanten einen ungeeigneten pH-Wert haben.

PBS phosphatgepufferte Salzlösung bei zwei verschiedenen pH-Werten. Quelle: Pixinio.com

In der Zwischenzeit ist die Kontrolle der Osmolarität insbesondere bei der Arbeit mit lebenden Zellen unerlässlich, da die Plasmamembranen der Zellen entsprechend der Konzentration der gelösten Stoffe reagieren, in denen sie sich befinden.

Wenn die Zellen auf ein hypertonisches Medium übertragen werden, werden sie dehydriert, da der Wassergradient zu der Seite transportiert wird, an der eine höhere Konzentration an gelösten Stoffen vorliegt. Wenn andererseits Zellen in ein hypotonisches Medium gegeben werden, absorbieren die Zellen Flüssigkeit, bis sie lysiert sind.

Aus diesem Grund wird PBS-Puffer für Laborprotokolle verwendet, bei denen die Zellen in vitro gewartet werden müssen. Auf diese Weise werden die Zellen nicht beschädigt.

PBS besteht aus einer Kombination von Salzen wie Natriumchlorid, Natriumphosphat, Kaliumchlorid und Kaliumphosphat. Die Zusammensetzung des PBS kann je nach Protokoll variieren.

Basis

Grundsätzlich besteht die Funktion des Phosphatpuffers darin, einen konstanten physiologischen pH-Wert zusammen mit einer Elektrolytkonzentration aufrechtzuerhalten, die derjenigen im Körper ähnlich ist.

In dieser Umgebung können die Zellen stabil bleiben, da die physiologischen Bedingungen so weit wie möglich simuliert werden.

Falls erforderlich, können der ursprünglichen PBS-Formulierung andere Verbindungen zugesetzt werden, beispielsweise ist die Zugabe von EDTA zu dem Puffer zum Waschen roter Blutkörperchen im Kreuzunverträglichkeitstest nützlich.

EDTA verhindert, dass die im Serum vorhandene Fraktion des Komplements C1 gespalten und an die roten Blutkörperchen lysiert wird, dh es vermeidet falsche Inkompatibilitätsergebnisse. Darüber hinaus hilft EDTA, Zellen zu dissoziieren.

Vorbereitung

Die Menge an Salzen, die für die Herstellung der PBS-phosphatgepufferten Salzlösung gewogen werden muss, hängt von der Menge ab, die hergestellt werden muss:

-Phosphat-gepufferte Salzlösung (10X PBS)

Für einen Liter Lösung:

Wiegen:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl,

11,5 g Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Vorbereitungstechnik

Die schweren Salze in ein Becherglas geben, ausreichend Wasser (80%) hinzufügen und auf der Rührplatte mit einem Magnetstab mischen, bis sich die Salze aufgelöst haben.

Herstellung von PBS unter Verwendung einer Rührplatte mit einem Magnetstab. Quelle: Benutzer: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtern, um ungelöste Partikel zu entfernen. Verwenden Sie Filter mit 0,45 µm Poren. Autoklavieren und aseptisch in einer Laminar-Flow-Haube in Gläsern mit Deckel verteilen.

Die 10X-Lösung (konzentriert) stellt den pH-Wert nicht ein. Die Einstellung erfolgt nach Verdünnung auf die 1X PBS-Pufferkonzentration (1:10 Verdünnung).

-Pufferphosphatsalzlösung (1X PBS)

1X PBS kann direkt hergestellt werden, wobei die entsprechenden Mengen jedes Salzes gewogen werden, oder es kann hergestellt werden, indem die Stammlösung (1:10) mit sterilem destilliertem Wasser verdünnt wird.

- Um direkt einen Liter 1X PBS phosphatgepufferte Salzlösung herzustellen, wiegen Sie:

8,06 g NaCl,

0,22 g KCl,

1,15 g Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 g KH ₂ HPO ₄

Vorbereitungstechnik

Verfahren Sie wie in der konzentrierten Lösung beschrieben. Anschließend muss der pH-Wert eingestellt werden. Messen Sie dazu den pH-Wert und verwenden Sie je nach Ergebnis Säure (HCl) oder Base (NaOH), um den pH-Wert nach Bedarf zu senken bzw. zu erhöhen, bis er 7,4 beträgt.

Die Säure oder Base wird tropfenweise zugegeben, während der pH-Wert der Lösung mit einem pH-Meter überwacht wird. Filtern, autoklavieren und nach Bedarf aseptisch in konische Röhrchen oder Gläser verteilen.

-Um 1X PBS aus der 10X Stammlösung herzustellen:

Machen Sie eine 1:10 Verdünnung. Um beispielsweise 1 Liter 1X PBS herzustellen, messen Sie 100 ml der Stammlösung ab und geben Sie 700 ml steriles destilliertes Wasser hinzu. Stellen Sie den pH-Wert ein und füllen Sie die Wassermenge auf 1000 ml.

Der hergestellte PBS-Puffer ist farblos und klar.

Tägliches PBS kann bei Raumtemperatur und der Rest im Kühlschrank aufbewahrt werden.

Lösungen zur pH-Einstellung

HCl

Für 100 ml 1 molare HCl (Salzsäure).

Messen Sie 91 ml destilliertes Wasser und geben Sie es in ein 250-ml-Becherglas.

Messen Sie 8,62 ml konzentrierte HCl und geben Sie sie langsam in das Becherglas mit dem Wasser (niemals umgekehrt). Treffen Sie beim Umgang mit starken Säuren (stark ätzende Substanzen) die entsprechenden Maßnahmen zur biologischen Sicherheit.

5 Minuten lang mischen, vorzugsweise unter Verwendung einer Rührplatte mit einem Magnetstab im Glas. In einen 100-ml-Kolben überführen und mit destilliertem H ₂ O auf 100 ml auffüllen.

NaOH

Für 100 ml NaOH (Natriumhydroxid) 10 molar.

Messen Sie 40 ml destilliertes Wasser und geben Sie es in ein 250-ml-Becherglas. 40 g NaOH abmessen und zum Wasser geben. Mischen Sie mit einer Rührplatte mit einem Magnetstab im Glas.

In einen 100-ml-Messkolben überführen und mit destilliertem Wasser bis zur Marke auffüllen. Beachten Sie die Vorschriften zur biologischen Sicherheit, da diese Reaktion exotherm ist (sie setzt Energie in Form von Wärme frei).

Wenn Sie andere Mengen Phosphat-Kochsalzlösung herstellen möchten, können Sie die folgende Tabelle konsultieren:

Quelle: «Labor für Virus- und Humangenomik, UASLP School of Medicine»

Anwendungen

Es wird hauptsächlich in den Bereichen Zellbiologie, Immunologie, Immunhistochemie, Bakteriologie, Virologie und Forschungslabors eingesetzt.

Es ist ideal zum Waschen von Zellen durch Zentrifugation (rote Blutkörperchen), Waschen von Zellmonoschichten, bei spektroskopischen Ellipsometrietechniken, bei der Quantifizierung von bakteriellen Biofilmen, bei der Aufrechterhaltung von Zellkulturen für Viren als Waschlösung bei der indirekten Immunfluoreszenztechnik und in Techniken zur Charakterisierung monoklonaler Antikörper.

Es wird auch verwendet, um Zellen oder Gewebe als Verdünnungsmittel für die Zellzählung, die Herstellung von zellulären Enzymen (Trypsin), als Verdünnungsmittel für das Trocknungsverfahren für Biomoleküle und zur Herstellung anderer Reagenzien zu transportieren.

Auf der anderen Seite haben Martin et al. 2006 gezeigt, dass PBS in forensischen Laboratorien nützlich ist, insbesondere bei der Gewinnung von Spermien aus Vaginalabstrichen oder bei der Gewinnung von Vaginalzellen aus Penisabstrichen. Auf diese Weise kann festgestellt werden, ob eine sexuelle Beziehung besteht.

Einschränkungen

-Einige PBS-Puffer enthalten eine Substanz namens Natriumazid als Konservierungsmittel. Diese Verbindung kann bei Kontakt mit Blei oder Kupfer explosive Substanzen erzeugen. Aus diesem Grund ist bei der Entsorgung dieses Reagenzes im Abfluss besondere Vorsicht geboten. Wenn es auf diese Weise verworfen wird, muss reichlich Wasser hinzugefügt werden, um es maximal zu verdünnen.

-Zink sollte dem Phosphatpuffer nicht zugesetzt werden, da dadurch einige Salze ausfallen.

-Wangen et al. Stellten 2018 fest, dass die Verwendung von PBS nicht zum Waschen von primären Zellen der akuten myeloischen Leukämie (AML) geeignet ist, die aus peripherem Blut extrahiert wurden, da viele Zellen durch Lyse verloren gehen und das Material stark abnimmt Protein.

Daher stellten sie fest, dass primäre AML-Zellen nach Lagerung in flüssigem Stickstoff nicht mit PBS gewaschen werden sollten.

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