BIURET: BEGRÜNDUNG, REAGENZIEN, VERFAHREN, VERWENDUNG - BIOLOGIE - 2025

Das Biuret ist ein Reagenz zur Proteinbestimmung, langkettig und kurzkettig. Es wird insbesondere im Bereich der analytischen Chemie und Urinanalyse zur Untersuchung der Konzentration von Gesamtproteinen in Serum, Plasma und Urin eingesetzt.

Proteinwerte können bei bestimmten Pathologien erhöht oder verringert werden. Hypoproteinämie-Symptome treten normalerweise bei Patienten mit Nierenerkrankungen, bei unterernährten Patienten und bei Patienten mit chronischen Infektionen auf.

Chemische Struktur des im Biuret-Reaktions-Positiv-Biuret-Test gebildeten Komplexes. Quelle: Yikrazuul / flickr

Während Hyperproteinämie unter anderem bei Pathologien wie multiplem Myelom, systemischem Lupus erythematodes, bakterieller Endokarditis, bakterieller Meningitis und Waldenstrom-Makroglobulinämie beobachtet wird.

Andererseits ist das Vorhandensein von Protein im Urin auf die Filtration von Albumin durch die Niere zurückzuführen. Dies ist ein pathologisches Verhalten, das untersucht werden muss.

In diesem Sinne ist das Biuret sehr nützlich, da es das Vorhandensein von Proteinen in Serum, Plasma, Urin und vielen anderen Proben quantifizieren kann.

Sogar das Biuret kann verwendet werden, um das Vorhandensein und die Konzentration von Proteinen in schlecht untersuchten Proben oder Proben unbekannter Zusammensetzung zu untersuchen. Daher ist es im Forschungsbereich weit verbreitet.

Der Biuret-Test basiert auf dem Nachweis von Peptidbindungen. Der Test findet in einem alkalischen Medium statt. Die Probe muss mindestens zwei Peptidbindungen enthalten, damit sich ein violett-violetter Komplex bildet. Der Komplex wird durch die Vereinigung der Bindungen und des Kupferions gebildet.

Basis

Das Biuret-Reagenz besteht aus Kaliumhydroxid, Kupfersulfat sowie Natrium- und Kaliumtartrat. Natriumhydroxid wird verwendet, um das Medium zu alkalisieren, da diese Bedingung für die Reaktion wesentlich ist.

Die Substanzen, die mit Proteinen reagieren, sind Kupfersulfat, während Natriumtartrat die Funktion hat, die Bildung von Kupferhydroxid nicht zuzulassen, das zur Ausfällung neigt und die Reaktion stört.

Wenn Substanzen mit Peptidbindungen (Polypeptide oder Proteine) in der Probe gefunden werden, ist der Test positiv.

Eine Reaktion wird als positiv interpretiert, wenn die Lösung lila wird. Die Farbe wird durch die Bildung eines Komplexes zwischen mindestens zwei Peptidbindungen erzeugt, die die CO-NH-Gruppe und die Kupferkationen aufweisen.

Der violette Komplex kann auf zwei Arten gebildet werden: Zum einen durch den Verlust von Protonen aus den Amidgruppen, die an das Metall binden (Depronotation), und zum anderen durch die Vereinigung der freien und bindenden Sauerstoff- und Stickstoffelektronen mit Kupfer.

Diese Reaktion kann je nach Art des Proteins in Intensität und Farbe variieren.

Der Test kann qualitativ oder quantitativ durchgeführt werden. In der qualitativen Form wird es als positiv oder negativ gemeldet. In quantitativer Form kann die Konzentration mit der spektrophotometrischen Methode gemessen werden.

Die Reaktion wird zwischen 540 und 560 nm abgelesen. Die Intensität der Farbe ist direkt proportional zur Konzentration der Peptidbindungen in der Probe.

Reagenzien

-20% Natriumhydroxid (NaOH)

-Cuprinsulfatpentahydrat 1% (CuSO _4, 5H ₂ O)

- Gemischtes Natrium- und Kaliumtartrat-Tetrahydrat (KNaC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

Stabilität des Biuret-Reagens

-Es muss gekühlt aufbewahrt werden.

Prozess

Technik

- 100 µl der zu analysierenden Probe oder des zu analysierenden Standards in ein Reagenzglas geben.

- 2 ml Natriumhydroxid hinzufügen.

-Mix sehr gut.

- 5 ml Biuret-Reagenz hinzufügen.

-Mischen und 25 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen, abdecken und vor Licht schützen.

- Beobachten Sie die Bildung von Farbe oder nicht und messen Sie spektrophotometrisch.

Kalibrierungskurve

Rinderserumalbumin kann als Standard zur Durchführung der Kalibrierungskurve verwendet werden. Daraus werden verschiedene Konzentrationen hergestellt. Zum Beispiel 25, 50, 75, 100, 125 und 150%.

Die Reaktion wird mit all diesen bekannten Konzentrationen aufgebaut und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 540 nm abgelesen. Mit den Daten der bekannten Konzentrationen und den Extinktionswerten wird die Kalibrierungskurve erstellt.

Bei jeder Bestimmung oder Charge von verarbeiteten Proben wird empfohlen, einen Standard zu montieren. Rinderserumalbumin 0,1-2 mg / ml kann als Kalibrierungsstandard verwendet werden.

Die Messungen werden mit einem Spektrophotometer bei 540 nm durchgeführt.

Die Linearität wird bis zu einer Konzentration von 12 g / dl erreicht.

Interferenz

Substanzen, die den Biuret-Test stören

Obwohl es nicht sehr häufig ist, sollte beachtet werden, dass einige Substanzen während der Durchführung dieses Tests stören können. Beispielsweise kann das Vorhandensein von Ammoniak die Farbbildung hemmen.

Ebenso könnten andere Substanzen wie bestimmte Pigmente bei derselben Wellenlänge absorbieren.

Andererseits kann eine Interferenz erzeugt werden, wenn eine andere Substanz als die Peptidbindung einen Komplex mit dem Kupfersalz bildet. Beispiel: einige Kohlenhydrate und bestimmte Lipide.

Falls die zu analysierende Probe einen Niederschlag aufweist, muss sie vor der Durchführung des Tests filtriert oder zentrifugiert werden.

Substanzen, die den Biuret-Test nicht stören

Der Test wird nicht beeinflusst durch:

-Bilirubin bis zu einer Konzentration von 20 mg / dl.

-Hämoglobin bis zu einer Konzentration von 750 mg / dl.

-Dextran bis zu einer Konzentration von 30 g / l.

-Triglyceride bis zu einer Konzentration von 4000 mg / dl.

Vorteil

-Es ist eine einfache Methode auszuführen.

-Es ist ein wirtschaftlicher Test.

-Es hat eine hohe Spezifität für Proteine.

-Leichte Störung.

Nachteile

Es hat eine geringe Empfindlichkeit zum Nachweis geringer Proteinmengen. Die von Fuentes et al. Durchgeführten Arbeiten bestätigen, dass die Biuret-Testmethode eine Nachweisgrenze von 1 mg / ml Protein und eine Bestimmungsgrenze von 3 mg / ml aufweist.

Andere an der Universität von Amazonien durchgeführte Untersuchungen berichten jedoch von viel niedrigeren Werten. Die in der Studie angegebene Nachweisgrenze liegt bei 0,020 mg / ml und die Bestimmungsgrenze bei 1,33 mg / ml.

Anwendungen

Das Biuret-Reagenz oder der Biuret-Test wird zur Bestimmung von Proteinen in klinischen und nichtklinischen Proben in Routine- und Forschungslabors verwendet.

Pathologien, die mit einer Zunahme oder Abnahme von auftreten

Bei vielen Pathologien ist es wichtig, die Konzentration der Gesamtproteine ​​in klinischen Proben zu bestimmen, die erhöht oder verringert sein können.

Sie sind erhöht in:

-Multiples Myelom,

-Systemischer Lupus erythematodes,

-Bakterielle Endokarditis,

-Bakterielle Meningitis,

Unter anderem Waldenstroms Makroglobulinämie.

Es ist verringert in:

-Niereninsuffizienz,

-Personen mit schwerer Unterernährung,

-Patienten mit chronischen Infektionen, unter anderem.

Klinische Proben

Die häufigsten klinischen Proben sind Serum, Plasma und Urin. Der Normalwert von Proteinen in Serum oder Plasma beträgt 6,0-8,8 g / dl.

Die Proteinkonzentration im Urin bei Erwachsenen überschreitet nicht die Zahl von 150 mg / 24 Stunden.

Normalwert des Verhältnisses von Urinprotein zu Urinkreatinin

Säuglinge: <0,50 mg

Kinder ab 2 Jahren: Index: 0,20 mg

Erwachsene: <0,2 mg

Nichtklinische Proben

Die Biuret-Reaktion kann für viele Arten von nichtklinischen Proben verwendet werden, z. B. Milchprodukte, Gegengifte oder unbekannte Substanzen, für die Sie das Vorhandensein von Proteinen untersuchen möchten.

Verweise

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