MÜELLER HINTON AGAR: BASIS, ZUBEREITUNG UND VERWENDUNG - BIOLOGIE - 2025

Der Müller-Hinton-Agar ist nicht selektiv, festes Nährmedium besteht aus Fleischinfusion, Pepton-Kasein, Stärke, Agar und destilliertem Wasser. Dieses Medium ermöglicht ein ausgezeichnetes mikrobielles Wachstum für die meisten schnell wachsenden Bakterien.

Es wurde ursprünglich von John Howard Müeller und Jane Hinton entwickelt, um ernährungsphysiologisch anspruchsvolle Bakterien wie Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis zu isolieren. Aufgrund seiner Eigenschaften erwies es sich jedoch als ideal für die Untersuchung der Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika und lieferte zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse.

Antibiogramme (Müeller Hinton Agar). Quelle: Dr. Graham Beards bei en.wikipedia

Daher ist Müeller-Hinton-Agar das vom Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) und dem Europäischen Komitee für antimikrobielle Empfindlichkeitstests akzeptierte Kulturmedium für die Durchführung des antimikrobiellen Empfindlichkeitstests nach der Kirby-Scheibendiffusionsmethode und Bauer.

Basis

Als nicht selektives Nährmedium eignet es sich hervorragend für das Wachstum der meisten pathogenen Bakterien.

Andererseits lässt seine einfache Zusammensetzung die Substanzen leicht darauf diffundieren, was ein wesentliches Merkmal für den Empfindlichkeitstest durch das Scheibendiffusionsverfahren ist.

Eine weitere Eigenschaft ist, dass es eine geringe Menge an Inhibitoren enthält, wodurch Sulfonamide, Trimethoprim und Tetracycline effektiv bewertet werden können.

Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass das Medium bestimmte Bedingungen erfüllen muss, um sein ordnungsgemäßes Funktionieren sicherzustellen, einschließlich:

Die Einstellung des pH-Wertes, der Tiefe des Agars und der geeigneten Konzentration von Thymin, Thymidin, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ und Zn ⁺⁺ .

Sie müssen auch wissen, dass die Methodik standardisiert ist und daher alle Parameter erfüllt sein müssen, wie z.

Die Inokulumkonzentration, die Konzentration und Konservierung der Antibiotika-Scheiben, die Platzierung der entsprechenden Anzahl von Scheiben auf dem Agar, der Abstand zwischen einer Scheibe und einer anderen, die strategische Platzierung bestimmter Antibiotika, die Atmosphäre, die Temperatur und die Zeit von Inkubation.

Vorbereitung

37 g dehydriertes Müeller-Hinton-Medium werden abgewogen und in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst. Erhitze das Medium unter Rühren, um die Auflösung zu unterstützen. 1 Minute kochen lassen.

Autoklavieren, um 15 Minuten bei 121 ° C zu sterilisieren. Beim Herausnehmen aus dem Autoklaven sollte der Kolben zum Abkühlen in ein Wasserbad bei 50 ° C gestellt werden. Gießen Sie 25 bis 30 ml in sterile Petrischalen mit 10 cm Durchmesser.

Die Platten sollten eine durchschnittliche Dicke von 4 mm haben (ideal), wobei ein Bereich von 3-5 mm zulässig ist.

Wenn Blutagar mit Müeller-Hinton-Agar als Basis hergestellt werden soll, gießen Sie vor dem Servieren auf die Platten 5% steriles und defibriniertes Lammblut.

Der endgültige pH-Wert des Mediums sollte zwischen 7,2 und 7,4 liegen.

Investieren und bis zur Verwendung im Kühlschrank aufbewahren. Lassen Sie die Platte vor Gebrauch auf Raumtemperatur kommen.

Die Farbe des vorbereiteten Mediums ist hellbeige.

Anwendungen

Es wird verwendet, um das Antibiogramm oder den Antibiotika-Empfindlichkeitstest für die meisten schnell wachsenden, nicht anspruchsvollen Krankheitserreger durchzuführen.

Wenn der Agar mit Blut ergänzt wird, wird er verwendet, um das Antibiogramm anspruchsvoller Mikroorganismen wie Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp., Neisseria meningitidis usw. durchzuführen. Es wurde auch verwendet, um Legionella pneumophila zu isolieren.

Antibiogramm-Technik

Vor der Durchführung des Antibiogramms muss eine Bakterienlösung hergestellt werden, die 1,5 x 10 ⁸ Zellen entspricht.

Hierzu werden 3 bis 4 Kolonien der Reinkultur entnommen und in einer Sojabohnen-Trypticase-Brühe oder in Müeller-Hinton-Brühe suspendiert, 2 bis 6 Stunden inkubiert und die Konzentration mit steriler Kochsalzlösung eingestellt, wobei sie mit einem Mac Farland-Standard von verglichen wird 0,5%.

Wenn sie Mikroorganismen benötigen, können Kolonien direkt bis zu einer Konzentration von 0,5% Mac Farland suspendiert werden. Anschließend wird die Müeller Hinton-Platte mit einem mit der vorbereiteten Bakterienlösung imprägnierten Tupfer ausgesät.

Dazu wird der Tupfer in die Lösung eingetaucht und anschließend überschüssige Flüssigkeit durch Drücken gegen die Wände des Röhrchens entfernt. Unmittelbar danach wird der Tupfer über die gesamte Oberfläche geführt, wobei keine Stellen unberührt bleiben. Dann wird die Platte leicht gedreht und erneut ausgesät. Der Vorgang wird noch zweimal wiederholt.

10 Minuten stehen lassen und dann die Antibiotika-Scheiben mit einer sterilen Pinzette einlegen, wobei ein Abstand von 24 mm zwischen ihnen verbleibt. Nachdem Sie jede Scheibe auf den Agar gelegt haben, drücken Sie leicht mit der Pinzette auf jede Scheibe, um sicherzustellen, dass sie gut haftet.

Sobald der Prozess beendet ist, wird die Platte umgedreht und 16 bis 18 Stunden bei 35 bis 37 ° C in Aerobiose inkubiert. Wenn es sich um einen anspruchsvollen Mikroorganismus handelt, kann es zu einer Mikroaerophilie kommen. Wenn das Antibiogramm Oxacillin-Scheiben enthält, sollte es nach 24 Stunden abgelesen werden.

Ein Lineal wird verwendet, um den Durchmesser jedes Halos zu messen. Die Ergebnisse sollten in mm aufgezeichnet werden. Anschließend werden die erhaltenen Werte mit den im aktuellen CLSI-Handbuch veröffentlichten Tabellen der Grenzpunkte korreliert.

Messung des Inhibitionshalos. Quelle: USCDCP, Pixnio.com

Berichten Sie als empfindlich (S), mittelschwer (I) oder resistent (R).

Antibiotika werden nach dem isolierten Mikroorganismus und der Art der Infektion ausgewählt, die er hervorruft.

Manchmal muss die strategische Platzierung von Antibiotika berücksichtigt werden, um phänotypische Resistenzmuster aufzudecken.

Strategische Disc-Platzierung auf Müeller Hinton-Agar

Bei Enterobakterien sollte die Clavulansäurescheibe gegen Cephalosporine der 3. und 4. Generation platziert werden. Eine eiförmige Verbreiterung zeigt an, dass der Stamm ein Produzent von Beta-Lactamasen mit erweitertem Spektrum (ESBL) ist. Dies bedeutet, dass der Patient nicht mit Cephalosporinen behandelt werden sollte.

Phänotypische Expression der Beta-Lactamase (ESBL) -Produktion mit erweitertem Spektrum in einem Escherichia coli-Stamm. Quelle: Foto des Autors MSc. Marielsa Gil

Bei Staphylococcus ist es wichtig, die Erythromycin- oder Azithromycinscheibe vor der Clindamycinscheibe zu platzieren (D-Test).

Ein resistenter Halo in Erythromycin und eine Abflachung im Clindamycin-Halo zeigen an, dass der Stamm eine durch Stamm induzierbare Clindamycin-Resistenz (ICR) besitzt. Dies bedeutet, dass eine Clindamycin-Behandlung nicht wirksam ist.

Um nach induzierbaren AMP C-Stämmen in Enterobacteriaceae und einigen nicht fermentierenden gramnegativen Stäbchen zu suchen, werden Tazobactan-Ceftazidim-, Cefoxitin- oder Piperacillin-Scheiben in einem Abstand von 27 mm gegen eine Imipenem-Scheibe gerichtet.

Ein abgeflachter Lichthof in einer der Scheiben, die dem Imipenem zugewandt sind, zeigt das Vorhandensein von induzierbarem AMP C an.

Für die Suche nach konstitutivem C-AMP wird eine 500-µg-Cloxacillin-Scheibe in einem Abstand von 25 mm mit Ceftazidim (30 µg) und Cefotaxim (30 µg) konfrontiert. Ein verbreiterter Lichthof in einem der Cephalosporine zeigt Positivität an.

Die Cloxacillinscheibe kann auch durch eine 9 mm Scheibe Whatman Nr. 6 Filterpapier ersetzt werden, die mit Phenylborsäure (400 ug) mit einem Abstand von 18 mm imprägniert ist. Es wird genauso interpretiert wie das vorherige.

Schließlich wird zur Untersuchung der Produktion von Metallobetalactamasen, insbesondere in Pseudomonas aeruginosa, eine mit 10 µl Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA 750 µg) und Thioglykolsäure (SMA 300 µg) imprägnierte Scheibe verwendet, die mit den Imipenem- und Meropenemscheiben konfrontiert ist. in einem Abstand von 15 mm.

Der Test ist positiv, wenn sich die Imipenem- oder Meropenem-Halos zur EDTA / SMA-Platte hin verbreitern. Dieses Ergebnis muss durch den modifizierten Hodge-Test bestätigt werden.

Diese Methode besteht darin, einen Escherichia coli ATCC 25922-Stamm auf die Müeller-Hinton-Platte zu inokulieren. Eine Imipenemscheibe wird in die Mitte der Platte gelegt, und dann wird mit dem vermuteten P. aeruginosa-Stamm ein Streifen von der Scheibe zur Peripherie gemacht. Pro Platte können bis zu 4 Stämme getestet werden.

Der Test ist positiv, wenn sich um die Dehnungsstreifen eine Verzerrungszone des Imipenem-Halos befindet.

Ursachen für fehlerhafte Ergebnisse

- Schlecht konservierte Antibiotika-Scheiben können zu falscher Resistenz führen. Beispielsweise ist die Oxacillinscheibe sehr anfällig für Temperaturänderungen.

- Ein pH-Wert des Mediums unter dem angegebenen Wert (sauer) erzeugt kleinere Halos in Aminoglycosiden und Makroliden (Risiko einer falschen Resistenz) und größere Halos in Penicillin, Tetracyclin und Novobiocin (Risiko einer falschen Empfindlichkeit).

-Wenn der pH-Wert über dem angegebenen Wert (alkalisch) liegt, sind die oben beschriebenen Effekte umgekehrt.

-Medien mit hohen Thymin- und Thymidinkonzentrationen haben einen Einfluss und reduzieren die Hemmhalos von Sulfonamiden und Trimethoprim signifikant.

-Hohe Konzentrationen an Calcium und Magnesium führen zu einer falschen Resistenz von Aminoglycosiden, Polymyxin B und Tetracyclinen gegen Stämme von Pseudomonas aeruginosa.

- Niedrige Konzentrationen von Calcium und Magnesium führen zu einer falschen Empfindlichkeit von Aminoglycosiden, Polymyxin B und Tetracyclinen gegenüber Stämmen von Pseudomonas aeruginosa.

-Das Vorhandensein von Zink beeinflusst die Ergebnisse von Carbapenem-Scheiben (Imipenem, Meropenem und Ertapenem).

- Mediendicke unter 3 mm führt zu falschen Empfindlichkeitsergebnissen, während Dicke über 5 zu falschem Widerstand führt.

-Die Mobilisierung der Bandscheiben im Antibiogramm führt zu deformierten Lichthöfen, da die Antibiotika sofort freigesetzt werden.

- Sehr schwache Inokulate beeinflussen die Ergebnisse, da der Agar nicht gleichmäßig oder konfluent wächst. Dies ist eine notwendige Voraussetzung, um die Hemmhalos messen zu können, zusätzlich zu der Tatsache, dass die Halos größer als normal sein können.

- Übermäßig beladene Inokula können Halos ergeben, die kleiner als normal sind.

- Wenn der Abstand zwischen den Discs nicht beachtet wird, überlappt sich ein Lichthof mit einem anderen und sie können nicht richtig gelesen werden.

-Inkubieren mit CO ₂ erhöht die Größe der Halos der Tetracyclin- und Methicillinscheiben.

-Inkubieren bei Temperaturen unter 35 ° C erzeugt größere Lichthöfe.

-Die Zugabe von Blut verringert die Größe des Sulfahalos.

Einschränkung

Die im Antibiogramm nachgewiesene Empfindlichkeit eines Antibiotikums gegen einen Mikroorganismus (in vitro) ist keine Garantie dafür, dass es in vivo wirkt.

QA

Um zu wissen, ob das Medium die ausreichende Menge an Thymin enthält, muss ein Stamm von Enterococcus faecalis ATCC 29212 gepflanzt und die Empfindlichkeit gegenüber Trimethoprimsulfamethoxazol (SXT) getestet werden. Um zufriedenstellend zu sein, muss ein Lichthof von mindestens 20 mm erhalten werden.

Verweise

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