REKOMBINANTE DNA: TECHNIK, ANWENDUNGEN UND GRUNDLAGEN - BIOLOGIE - 2025

Die rekombinante DNA (rDNA oder rDNA) ist ein künstliches Nukleinsäuremolekül, das im Labor durch Integration von zwei Segmenten von Interessenorganisationen erzeugt wird. Aufgrund seiner hybriden Eigenschaft ist es auch als chimäre DNA bekannt. Diese Art von DNA kommt in der Natur nicht vor.

Die grundlegende Methode zur Erzeugung umfasst: (a) die Auswahl einer Ziel-DNA und ihre Insertion in ein anderes DNA-Fragment (im Allgemeinen ein Bakterienplasmid); (b) die Einführung dieses Plasmids in ein Bakterium, (c) die Selektion der Bakterien mittels Antibiotika und schließlich (d) die Expression des Gens.

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Die Technik nutzt eine Reihe von Enzymen, die es ermöglichen, bestimmte DNA-Fragmente nach Einschätzung des Forschers zu kopieren und einzufügen.

Das Ziel der rekombinanten Technologie ist in den meisten Fällen die Expression eines Proteins (bekannt als rekombinantes Protein), das der Molekularbiologe für zukünftige Forschungen oder zur Schaffung eines Proteins von kommerziellem und therapeutischem Wert - wie Humaninsulin - wünscht. beispielsweise.

Grundlagen der rekombinanten DNA-Technik und ihrer Verwendung in der Gentechnik

Das zentrale Dogma der Molekularbiologie

Alle organischen Wesen, die wir kennen, haben mehrere Eigenschaften gemeinsam. Eine davon ist die Art des genetischen Materials und die Art und Weise, wie Proteine ​​hergestellt werden - ein Prozess, der als zentrales „Dogma“ der Molekularbiologie bekannt ist.

Mit Ausnahme einiger Viren speichern alle Organismen genetische Informationen in DNA (Desoxyribonukleinsäure), die sehr kompakt und organisiert im Zellkern gesammelt wird.

Zur Genexpression wird das DNA-Molekül in Messenger-RNA transkribiert und letztere in die Sprache der Aminosäuren, der Bausteine ​​von Proteinen, übersetzt.

Was ist eine rekombinante DNA?

Zwischen den 1970er und 1980er Jahren begannen Molekularbiologen, die natürlichen Prozesse in der Zelle zu nutzen und sie auf das Labor zu extrapolieren.

Auf diese Weise könnte ein Gen tierischen Ursprungs (zum Beispiel ein Wirbeltier) aus einem Bakterium in ein DNA-Segment eingefügt werden; oder die DNA eines Bakteriums könnte mit einer viralen DNA kombiniert werden. Somit können wir eine rekombinante DNA als ein Molekül definieren, das aus DNA von zwei verschiedenen Organismen besteht.

Sobald dieses hybride oder rekombinante Molekül erzeugt wurde, wird das interessierende Gen exprimiert. Mit dem Wort Ausdruck wollen wir uns auf den Prozess der Übersetzung in Protein beziehen.

Restriktionsenzyme und Ligasen: der Schlüssel zum Prozess

Ein Schlüsselelement bei der Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie war die Entdeckung von Restriktionsenzymen.

Dies sind Proteinmoleküle, die die Fähigkeit aufweisen, DNA (Nukleasen) in spezifische Sequenzen zu spalten, die als „molekulare Schere“ dienen. Die von diesen Enzymen erzeugten Fragmente werden Restriktionsfragmente genannt.

Diese Enzyme können symmetrische Schnitte in der Zielsequenz (in beiden Ketten auf gleicher Höhe) oder asymmetrische Schnitte erzeugen. Ein Schlüsselaspekt der Wirkung von Restriktionsenzymen besteht darin, dass nach der Spaltung der Ketten eine "lose Kante" erhalten wird, die zu der anderen Kante, die von demselben Enzym geschnitten wird, komplementär ist.

Einige Beispiele sind ECOR 1 und Sma 1. Derzeit sind mehr als 200 Arten von Restriktionsenzymen bekannt und im Handel erhältlich.

Um nützlich zu sein, muss eine Schere vom Kleber begleitet werden. Diese Versiegelungswirkung der DNA (zuvor mit Restriktionsenzymen behandelt) wird durch Ligasen ausgeführt.

Technik: Wie wird die DNA eines Organismus im Labor künstlich verändert?

Im Folgenden werden die Hauptschritte beschrieben, die für die rekombinante DNA-Technologie erforderlich sind. Alle werden von Fachleuten in einem molekularbiologischen Labor durchgeführt.

Was ist ein "Klon"?

Bevor wir mit dem experimentellen Protokoll fortfahren, müssen wir beachten, dass in der Molekularbiologie und Biotechnologie der Begriff "Klon" und das Verb "Klon" weit verbreitet sind. Dies könnte zu Verwirrung führen.

In diesem Zusammenhang beziehen wir uns nicht auf das Klonen eines ganzen Organismus (wie zum Beispiel im Fall des berühmten Schafs Dolly), sondern auf das Klonen eines DNA-Stücks, das ein Gen sein kann. Das heißt, es werden viele genetisch identische Kopien der Sequenz hergestellt.

1. Isolierung und Gewinnung von DNA

Der erste Schritt besteht darin, zu entscheiden, welche Sequenz Sie verwenden möchten. Dies hängt ganz vom Forscher und den Zielen seiner Arbeit ab. Diese DNA muss dann isoliert und gereinigt werden. Die Methoden und Verfahren, um dies zu erreichen, hängen wiederum vom Körper und vom Gewebe ab.

Im Allgemeinen wird ein Stück Gewebe entnommen und in einem Lysepuffer mit Proteinase K (einem proteolytischen Enzym) behandelt, und dann wird die DNA extrahiert. Anschließend wird das genetische Material in kleine Fragmente fragmentiert.

2. Klonierungsvektor

Nach den vorbereitenden Schritten versucht der Forscher, das interessierende DNA-Segment in einen Klonierungsvektor einzuführen. Von nun an werden wir dieses Segment der DNA weiße DNA nennen.

Plasmide

Einer der am häufigsten verwendeten Vektoren in einem Plasmid bakteriellen Ursprungs. Ein Plasmid ist ein doppelsträngiges, zirkuläres DNA-Molekül, das natürlicherweise in Bakterien vorkommt. Sie sind dem bakteriellen Chromosom fremd - das heißt, sie sind extrachromosomal und kommen natürlicherweise in diesen Prokaryoten vor.

Die Grundelemente eines Vektors sind: (a) ein Replikationsursprung, der die DNA-Synthese ermöglicht; (b) Selektionsmittel, das es ermöglicht, die Organismen, die das Plasmid tragen, mit der Ziel-DNA zu identifizieren, wie etwa die Resistenz gegen ein Antibiotikum; und (c) Multiklonierungsstelle, wo die Sequenzen gefunden werden, die von den Restriktionsenzymen erkannt werden.

Die erste erfolgreiche rekombinante DNA im Labor wurde aus dem Bakterium E. coli in das Plasmid pSC101 kloniert. Diese enthält neben dem Replikationsursprung eine Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym EcoRI und ein Gen für die Resistenz gegen ein Antibiotikum.

Die Insertion der Ziel-DNA in das Plasmid erfolgt unter Verwendung der im vorherigen Abschnitt beschriebenen molekularen Werkzeuge von Restriktionsenzymen und Ligasen.

Verbleibende Vektortypen

Zusätzlich zu Plasmiden kann DNA in andere Vektoren wie Bakteriophagen Lambda, Cosmide, YACs (künstliche Hefechromosomen), BACs (bakterielle künstliche Chromosomen) und Phagemide inseriert werden.

3. Einführung von rekombinanter DNA

Sobald das rekombinante DNA-Molekül (Gen von Interesse im Plasmid oder einem anderen Vektor) erhalten wurde, wird es in einen Wirt oder Wirtsorganismus eingeführt, der ein Bakterium sein kann.

Um fremde DNA in ein Bakterium einzuführen, wird eine als bakterielle Transformation bezeichnete Technik verwendet, bei der der Organismus einer Behandlung mit zweiwertigen Kationen unterzogen wird, die ihn für die DNA-Aufnahme anfällig macht.

Methodisch können wir nicht garantieren, dass 100% der Bakterien in unserer Kultur unser rekombinantes DNA-Molekül effektiv aufgenommen haben. Hier kommt der Teil des Plasmids ins Spiel, der Antibiotikaresistenz enthält.

Somit sind die Bakterien, die das Plasmid aufgenommen haben, gegen ein bestimmtes Antibiotikum resistent. Um sie auszuwählen, reicht es aus, das Antibiotikum anzuwenden und die Überlebenden zu nehmen.

4. Das Protein "ernten"

Nachdem wir die Bakterien mit unserer rekombinanten DNA ausgewählt haben, verwenden wir die enzymatische Maschinerie des Wirts, um das interessierende Proteinprodukt zu erzeugen. Während sich die Bakterien vermehren, wird das Plasmid an ihre Nachkommen weitergegeben, so dass es während der Teilung nicht verloren geht.

Dieses Verfahren verwendet die Bakterien als eine Art Protein "Fabrik". Später werden wir sehen, dass es ein sehr relevantes Verfahren bei der Entwicklung wirksamer medizinischer Behandlungen war.

Sobald die Kultur fertig ist und die Bakterien große Mengen an Protein produziert haben, wird die Zelle lysiert oder zerstört. Es gibt eine breite Palette biochemischer Techniken, die die Reinigung von Proteinen gemäß ihren physikochemischen Eigenschaften ermöglichen.

In einem anderen experimentellen Kontext sind wir möglicherweise nicht daran interessiert, das Protein zu erzeugen, sondern daran, die DNA-Sequenz an sich zu erhalten. Wenn dies der Fall wäre, würde das Plasmid verwendet, um mehrere Kopien des interessierenden Fragments zu erstellen, um genug von der Ziel-DNA zu haben, um die relevanten Experimente durchzuführen.

Anwendungen

Die rekombinante DNA-Technologie eröffnete unendlich viele Möglichkeiten in der Molekularbiologie, Biotechnologie, Medizin und anderen verwandten Bereichen. Die herausragendsten Anwendungen sind die folgenden.

Genetische Analyse

Die erste Anwendung steht in direktem Zusammenhang mit molekularbiologischen Labors. Die rekombinante DNA-Technologie ermöglicht es Forschern, die normale Funktion von Genen zu verstehen, und die erzeugten Proteine ​​können für weitere Forschungen verwendet werden.

Pharmaindustrie

Mit dem rekombinanten DNA-Verfahren hergestellte Proteine ​​finden Anwendung in der Medizin. Zwei sehr relevante Beispiele auf diesem Gebiet sind Humaninsulin und Wachstumshormon, die bei Patienten angewendet werden, denen dieses Protein fehlt.

Dank rekombinanter DNA können diese Proteine ​​erzeugt werden, ohne dass sie aus einem anderen Menschen extrahiert werden müssen, was zusätzliche methodische Komplikationen und Gesundheitsrisiken darstellt. Dies hat dazu beigetragen, die Lebensqualität unzähliger Patienten zu verbessern.

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